再生障礙性貧血患者造血微環境變化的研究進展

尹相叢，楊頡， 閆麗萍，趙春亭

青島大學附屬醫院，山東青島266001

造血微環境是指骨髓造血細胞增殖、分化的全部環境因素，是由基質細胞、細胞外基質和造血生長因子三部分組成的[1]，其共同構成了造血細胞存活所必需的生理結構支架和信號傳導載體[2]，是造血系統的重要組成部分，具有支持造血細胞增殖及促使造血細胞向各個血細胞增殖分化的作用。再生障礙性貧血(AA)是由于物理、化學、生物或其他不明因素作用使骨髓中造血干細胞(HSC)和骨髓造血微環境受損，造成骨髓造血功能降低或衰竭，并以全血細胞減少為主要表現的一組綜合征。AA的發病機制涉及免疫紊亂、造血微環境改變等多個方面。本文對AA患者造血微環境的相關變化作一綜述。

1 骨髓間充質干細胞(BMSCs)相關異常

1.1 細胞增殖緩慢、數量減少、特性改變 骨髓基質細胞主要包括BMSCs、成纖維細胞、脂肪細胞、內皮細胞、成骨細胞等，是造血微環境的重要成分之一，能夠分泌多種造血調控因子。BMSCs是骨髓基質細胞的前體細胞，主要來源于中胚層，是一種具有多向分化潛能的干細胞[3]，能夠分泌多種細胞因子，具有低免疫原性、免疫調節性及支持造血的功能[4]。在一定的誘導條件下，BMSCs可分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、骨髓間質細胞等多種間質細胞[5]。在維持骨髓微環境穩態、調控HSC的生理功能中發揮著重要作用[6]。研究發現，與正常成人相比，AA患者BMSCs數量減少、增殖能力降低、生長緩慢，且促進骨髓粒細胞-單核細胞集落形成單位(CFU-GM)生長的作用明顯減弱[7]。BMSCs增殖緩慢、數量減少、特性改變均與AA嚴重程度、病程等有關，BMSCs的上述變化在重型、病程較長或繼發于放化療后的AA患者中尤其明顯。

1.2 抑制T淋巴細胞的作用減弱 正常的BMSCs具有抑制T淋巴細胞的功能，可為HSC提供免疫保護環境。正常人BMSCs可抑制植物血凝素刺激后的T淋巴細胞增殖，且這種作用會隨著BMSCs數量的增加而增強。AA患者BMSCs在細胞形態和免疫表型上與正常人沒有明顯差異，但其BMSCs對T淋巴細胞的抑制作用較正常人減弱[8]。BMSCs能夠使T淋巴細胞停留在G0或G1期，從而抑制T淋巴細胞的增殖和活化，并使CD25、CD69等T淋巴細胞早期活化表型的表達下降，抑制IL-2、IFN-γ分泌，而AA患者的BMSCs缺乏這種免疫抑制作用。Bacigalupo等[9]也發現，重型AA患者的BMSCs在抑制T淋巴細胞生成、增殖方面存在不足，且不能通過免疫治療得到糾正，但經HSC移植后可恢復正常。BMSCs對T淋巴細胞的抑制作用減弱會影響骨髓局部的免疫調節，從而影響骨髓正常造血。

1.3 成脂性增強 正常情況下BMSCs成脂和成骨分化處于動態平衡，而AA患者BMSCs成脂及成骨分化發生失衡[10,11]，AA患者骨髓中正常造血組織減少并被脂肪組織取代。研究發現，AA患者BMSCs向脂肪細胞分化的能力增強，形成脂滴時間早、數量多、體積大；且在誘導BMSCs形成脂肪細胞的過程中，早期脂蛋白酯酶基因表達明顯升高。在正常人的脂肪細胞誘導體系中，轉化生長因子β1(TGF-β1)可促進 BMSCs增殖，并抑制其成脂分化。而AA患者BMSCs的易成脂性可能與TGF-β1信號傳導通路出現異常，TGF-β1及其下游第1個分子信號Smad3表達下調有關。另有研究發現，AA患者BMSCs脂肪化能力明顯增強[12]，且脂聯素、FABP基因及蛋白表達顯著升高[13]。AA患者BMSCs成脂性增強導致成骨細胞減少，而成骨細胞也被證實參與了對HSC早期分化調控的介導，是骨髓造血微環境中重要細胞成分之一，在HSC發育、增殖、分化及成熟過程中發揮重要的調控作用[14]。成骨細胞數量減少將影響骨髓HSC的增殖和分化，也可直接影響骨髓基質細胞間的相互作用，導致造血微環境異常。另外有研究表明，骨髓脂肪細胞可過度分泌瘦素等細胞因子，而且AA患者HSC對干細胞因子(SCF)的反應性降低并且其瘦素受體不完整，均破壞了瘦素與SCF刺激HSC增殖的協同效應，可能進一步導致AA患者瘦素水平增高及HSC數量減少。因此，BMSCs成脂性增強導致造血微環境改變可能是AA患者骨髓功能減弱的原因之一。

1.4 細胞凋亡增加 研究表明，AA患者BMSCs凋亡率明顯升高，導致BMSCs數量減少，同時也對HSC產生影響[15]。通過基因芯片分析骨髓BMSCs結果顯示，AA患者大量與細胞增殖、分化、凋亡、造血發生及免疫應答等相關的基因表達發生明顯改變，也進一步證實了AA患者BMSCs的生物學特性發生異常[16]。

2 細胞外基質改變

AA患者最主要的骨髓病理表現是造血細胞減少、脂肪細胞增多，同時伴有骨髓基質細胞萎縮、成纖維細胞集落形成單位(CFU-F)減少、靜脈竇壁水腫、毛細血管壞死等現象，其中急性AA較慢性AA更明顯。而骨髓基質細胞受損的患者行HSC移植的成功率比較低，也提示造血微環境缺陷在AA發病中具有重要作用。

AA患者骨髓微環境中存在微血管破壞和血管新生減少[17]。Füredre等[18]應用免疫組化法檢測AA患者骨髓中微血管密度和血管內皮生長因子(VEGF)表達，結果發現初診AA患者骨髓微血管密度及VEGF表達均明顯低于正常人群，而治療有效后的AA患者兩者水平明顯提高。VEGF是對血管生成和造血具有重要作用的因子之一。AA患者VEGF表達降低可減少骨髓血管生成，引起骨髓局部氧供和血供均降低，從而使造血組織萎縮，骨髓出現脂肪化，導致正常的造血功能受到抑制。VEGF可通過內在的自分泌環調節和維持HSC生存和增殖，VEGF表達過低可直接影響HSC增殖、發育和分化，從而影響造血功能。因此，VEGF表達降低可能與AA的發生、進展及病情嚴重程度有關。國內還有研究發現，AA患者骨髓源血管緊張素Ⅱ水平低于正常人群，推測骨髓血管緊張素Ⅱ水平降低也可能是AA患者造血微環境改變的重要因素之一。

AA患者血管細胞黏附分子1及細胞間黏附分子1等基因表達增高，而整合素1與整合素133等基因表達下降，說明AA患者骨髓微環境中HSC與基質細胞及細胞外基質成分間的黏附相互作用被破壞，導致HSC過早凋亡。另外TGF-β1參與了免疫調控及造血調控，可能也與AA的發病有關。TGF-β1是由Th3細胞分泌的，對免疫應答發揮負調節作用。研究發現，重型AA患者血漿TGF-β1水平明顯下降，且與Th3細胞比例及血小板數量呈正相關關系，說明Th3細胞及其分泌TGF-β1水平可反映重型AA患者的病情。TGF-β1減少可能減弱了自身免疫耐受，使T淋巴細胞針對自身骨髓的免疫破壞功能亢進。

3 HSC相關異常

HSC是由胚胎干細胞發育而來的各類血細胞的祖源細胞，能夠自我更新、自我復制，且有較強的多向分化能力。AA患者的HSC異常已得到公認[19]。AA患者應用免疫抑制治療后有效率可達70%～80%，但仍有一部分患者存在緩解率低、造血功能恢復不理想和復發等問題，而HSC移植成功后患者骨髓造血功能恢復，也表明其骨髓可能存在HSC數量及功能異常。

3.1 HSC細胞數量減少 HSC又被稱為多能干細胞，CD34+是其特異性標志，AA患者骨髓中的CD34+細胞比例明顯低于正常人，且其降低程度與病情嚴重程度呈正相關關系；同時AA患者骨髓啟動細胞(LTC-IC)數量明顯減少甚至缺乏，CFU-GM和紅細胞集落形成單位(CFU-E)形成能力降低。AA患者HSC異常主要是HSC數量減少造成的，尤其是表達CD34+、CD38-的早期HPC數量明顯減少甚至缺乏。研究證實，AA患者骨髓中不僅HSC數量降低，而且集落形成細胞或經原始細胞長期培養的純化CD34+細胞比例也低于正常人群[20]。Fischer等[21]研究發現，兒童AA患者骨髓CD34+細胞比例也明顯降低，而CD34+細胞表面相關凋亡誘導配體(TRAIL)表達增加。CD34+主要表達于早期造血干細胞，在其黏附和歸巢過程中具有重要作用。因此，檢測骨髓中CD34+細胞的表達水平已成為診斷AA的方法之一，也可以初步評估AA患者的嚴重程度，并有助于治療方法的選擇以及預后判斷。CD34+細胞極度降低的患者往往免疫抑制治療效果不理想，可能與未從根本上糾正干細胞的內在缺陷有關。但是經同基因HSC移植成功后，患者的造血功能可得到恢復，也提示了AA患者存在HSC數量及功能異常。因此，臨床上應用HSC移植和抗胸腺細胞球蛋白聯合環孢菌素A和雄激素治療AA的效果較好[22,23]。

3.2 HSC細胞功能異常 AA患者不僅存在HSC數量降低，還存在細胞功能異常。研究發現，將AA患者CD34+細胞置于正常人的髓基質中培養，可出現集落生成障礙；反之，將正常人CD34+細胞置于AA患者的骨髓基質中培養，集落生成則無顯著差異；這表明AA患者的HSC可能存在功能缺陷或異常。臨床上部分AA患者經正常人HSC進行骨髓移植治療后取得良好效果，也證明了AA患者HSC存在功能異常或缺陷。研究證實，雖然AA患者的骨髓造血功能衰退，但其體內大部分造血生長因子水平與正常人相比并沒有明顯變化。由此推測，HSC對造血生長因子的反應性降低甚至無反應，可能是由于受體分布、功能、胞內合成及細胞內信號傳導等因素異常而導致的，最終影響患者的骨髓造血功能。

3.3 HSC細胞凋亡增加 細胞凋亡異常是HSC損傷的重要機制之一，AA患者骨髓HSC細胞CD34+細胞上死亡或凋亡的相關基因及造血負調控因子表達明顯升高。AA患者HSC凋亡增加與造血生長因子減少、促凋亡細胞因子增多、凋亡相關分子表達增加等因素有關。造血負調控因子可通過一些信號途徑參與誘導HSC凋亡，而Fas和Fas配體(FasL)是一對促凋亡基因，其中Fas(Apo-1/CD95)蛋白屬于TNF和神經生長因子受體成員之一，FasL屬于TNF家族成員。AA患者IFN-γ和TNF-β等造血負調控因子表達升高，可上調CD34+細胞上的Fas抗原表達；同時使其對Fas/FasL途徑介導的細胞凋亡敏感性增加，通過Fas/FasL途徑啟動細胞凋亡程序，使凋亡細胞比例增加[24]。

研究表明，NO也可能參與了AA患者HSC異常凋亡，IFN-γ、TNF-α和IL-1等可誘導NO合酶的合成，NO生成增加，導致HSC的DNA損傷，從而引起細胞凋亡增加[25]。IL-1B也可通過IL-1B轉化酶途徑促進HSC凋亡，而CTL介導的細胞毒作用可導致HSC的直接損傷。最近有研究顯示，正常CD34+細胞的存活與自噬密切相關，而AA患者CD34+細胞的自噬能力受損，導致CD34+細胞的分化和增殖減少，而對凋亡的敏感性增加[26]。因此，自噬可能在AA的發病機制中發揮重要作用。

4 基因改變

4.1 人白細胞抗原(HLA)基因多態性 HLA是由200多個基因座位組成的基因復合體，其編碼的基因位于第6號染色體短臂上6p21.3，全長4 000 kb。HLA與調節免疫應答有關，在目前已知基因中HLA等位基因的多態性最高。國內外報道均顯示，HLA等位基因多態性與AA發病易感性有關[27]。某些HLA表型在AA患者中的比例較高，呈連鎖不平衡，HLA-DR2陽性可作為AA患者免疫抑制治療的預測指標[28]。通過對AA患者的HLAⅡ類抗原進行分析，發現環孢素A依賴者具有共同的HLAⅡ類單體型DRB1*1501、DQA1*0102、DQB1* 0602，且其第2外顯子無核苷酸序列多態性，而對環孢素A治療有效但不依賴者則不具備這些分型特征[29]。HLA-DRB1*150是HLA-DR2的主要亞型，很可能是AA的易感基因之一。Taj等[30]研究發現，AA患者的 HLA-B5基因頻率明顯高于正常人。Akram等[31]發現，HLA-DRB1*15和DQB1*06與巴基斯坦人群AA發病密切相關。而Wang等[32]研究發現，在中國北方漢族人群中，HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1等位基因多態性與AA的發病有關。HLA-B*1302、HLA-B*3501、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0901和 HLA-DQB1*0202可能是AA的易感基因 ，而HLA-A*3303和HLA-DQB1*0302可能是AA的保護基因。以上研究結果均提示，HLA-DR基因的某些亞型可能是導致AA發病的遺傳學基礎。

4.2 端粒酶改變 端粒是由DNA及其相關蛋白組成的富含G的DNA重復序列，存在于真核細胞染色體末端，能夠保護染色體末端不被降解、融合和重組，具有保證染色體完整性的作用。端粒的長度決定了細胞的復制潛能，體細胞每分裂1次，端粒就會縮短50～200 bp，當端粒縮短到一定程度就會導致細胞復制的停止，細胞會因為喪失復制能力而停滯在細胞生長周期的某個階段，最終進入凋亡程序[33]。端粒的長度需要端粒酶的維持，端粒酶是一種核酸蛋白酶，具有延長端粒末端的作用。端粒酶是以其內源性RNA為模板，添加序列到端粒末端，以維持端粒長度，并保持其結構完整。人類端粒酶主要組分包括端粒酶RNA組分(TERC)、端粒酶相關蛋白(TEP)、端粒酶逆轉錄酶(TERT)3種。

骨髓衰竭尤其是遺傳性的骨髓衰竭可能與端粒酶缺陷有關，部分獲得性AA患者也存在端粒縮短的現象[34]。近年來有關端粒縮短及端粒酶基因突變與AA之間的關系也是AA發病機制的研究熱點之一。Han等[35]對AA患者粒細胞的端粒長度進行研究，發現與同年齡段正常人相比，AA患者端粒長度明顯縮短，推測可能與HSC造血功能缺陷有關。Shallis等[36]對AA患者TERT基因進行分析，結果發現其編碼端粒酶RNA成分的TERT基因雜合性突變率高于正常對照組，端粒酶活性減低，該基因突變可能是導致AA發生的危險因素。Wang等[36]研究也發現，AA患者HSC的端粒保護蛋白表達明顯降低，TERC和TERT基因發生突變，而且這些改變與病情嚴重程度呈正相關關系。Cui等[37]研究發現，AA患者線粒體基因突變和端粒長度改變存在相關性，且兩者與骨髓造血功能衰竭均密切相關。端粒縮短是由于線粒體DNA受損，其功能受到影響所致，進而可影響細胞的分裂復制，最終引起骨髓造血功能衰竭。因此，端粒酶相關基因突變和端粒縮短均可能與AA易感性有關。

4.3 谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)基因缺乏 GST是一種能夠對誘導機體突變物質解毒的親電子復合物，參與機體中毒物和一些致畸物，如苯及其衍生物等代謝。GSTT1缺乏可導致機體喪失對外界有毒物質或致癌物質的代謝作用，對致畸變物轉化能力下降，導致個體易于發生骨髓衰竭。Rehman等[38]對巴基斯坦137例AA患者和220例正常對照組進行研究發現，AA患者GSTM1基因缺陷比例高于正常對照組。因此，GSTT1缺乏或者GSTT1和GSTM1同時缺乏的個體罹患AA的風險更高。該研究GSTT1基因缺乏的AA患者中，部分在確診時即發現伴有染色體異常；這提示GSTT1基因缺乏人群可能由于外界有毒物質而導致其染色體畸變和不穩定性，從而導致AA易感性升高。

綜上所述，AA患者造血微環境中存在BMSCs增殖緩慢、數量減少、特性改變、抑制T淋巴細胞的作用減弱、成脂性增強、細胞凋亡增加，細胞外基質改變，HSC細胞數量減少、凋亡增加、功能異常，HLA基因多態性、端粒酶改變、GST基因缺乏等基因改變。造血微環境對骨髓造血細胞起支持誘導作用，其中的各個成分參與AA的免疫病理過程，與AA的發生發展密切相關，對AA造血微環境的研究有助于揭示其病理機制、指導臨床治療和判斷預后。