miR-125a-5p對人多發性骨髓瘤U266細胞增殖的影響及其與維生素D受體的關系

趙進，王昌敏

新疆維吾爾自治區人民醫院，烏魯木齊830001

多發性骨髓瘤(MM)是一種由于漿細胞惡性增殖導致的血液惡性腫瘤，多發于老年人[1]。MM發病率占所有血液性惡性腫瘤的13%，是臨床常見的惡性腫瘤之一[2]。MM的主要臨床特征為溶骨性骨病變、高鈣血癥、腎功能不全、免疫球蛋白水平下降和骨髓血管生成增加等[3]。維生素D是骨骼代謝的基本介質，具有調節鈣穩態的作用，維生素D缺乏可影響骨礦化和骨吸收過程。維生素D受體(VDR)屬于二類核受體家族，維生素D主要通過作用于VDR而發揮生物學作用。盡管包括蛋白酶體抑制劑和免疫調節劑在內的新型藥物可有效改善MM患者的臨床癥狀，但其整體治療效果仍不理想，患者中位生存期僅為7年[4,5]。微小RNA(miRNA)是內源性的非編碼RNA，主要通過與靶基因mRNA結合而調控基因表達。研究表明，miRNA在包括MM在內的多種癌癥的發生和發展過程中發揮重要作用[6,7]。2018年1月～2019年12月，本研究觀察了miR-125a-5p在MM細胞中的表達變化及其對細胞增殖的影響，并探討其與VDR的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人多發性骨髓瘤細胞系U266、人正常骨髓原代細胞均購自美國ATCC細胞庫。主要試劑：10%胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI 1640培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司，M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、oligo dT、SYBR MasterMix均購自上海遠慕生物科技有限公司；qPCR試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，TRIzol試劑盒購自日本TaKaRa公司，抗VDR抗體購自美國Abcam公司。miR-125a-5p引物序列由上海生工生物工程有限公司設計合成。

1.2 U266細胞、人正常骨髓原代細胞 miR-125a-5p表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。將U266細胞、人正常骨髓原代細胞置于含10%胎牛血清和適量青-鏈霉素的RPMI 1640培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。取生長狀態良好的兩種細胞，采用TRIzol法提取總RNA，通過逆轉錄酶在20 μL體系中合成cDNA。miR-125a-5p上游引物5′-AGCGCGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，長度83 bp；下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，長度164 bp。內參GAPDH上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，長度18 bp；下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′，長度23 bp。PCR反應條件：95 ℃預變性 10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40 個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-125a-5p相對表達量。

1.3 U266細胞、人正常骨髓原代細胞VDR蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取生長狀態良好的 U266細胞、人正常骨髓原代細胞，在含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中裂解細胞，提取總蛋白。BCA法統一定量蛋白樣品，隨后取相同量蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳分離。電泳結束后將蛋白質電轉移至甲醇浸泡的PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。封閉結束后加入VDR及內參GAPDH一抗(稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500)，4 ℃孵育過夜；第二天加入HRP標記的二抗(稀釋比例為1∶1 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌，ECL法顯影，條帶曝光后采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算VDR蛋白相對表達量。

1.4 miR-125a-5p與VDR的相互作用觀察 TargetScan軟件分析結果顯示miR-125a-5p可與VDR序列配對，見圖1。采用雙熒光素酶報告基因檢測miR-125a-5p與VDR的相互作用。方法如下：取對數生長期 U266細胞，以1×104/L接種于6孔板，作用24 h。將 U266細胞隨機分為四部分，分別采用Lipofectamine 2000轉染VDR-wt+NC質粒、VDR-wt+miR-125a-5p mimic質粒、VDR-mut+NC質粒、VDR-mut+miR-125a-5p mimic質粒。轉染48 h，加入PLB裂解細胞。將上清液轉移至不透光96孔酶標板，加入Luciferase Assay Reagent Ⅱ(100 μL)反應20 min，采用酶標儀檢測熒光素酶相對活性。

圖1 TargetScan軟件分析miR-125a-5p與VDR序列配對結果

1.5 miR-125a-5p靶向VDR對U266細胞增殖能力影響的觀察

1.5.1 細胞分組處理 取生長狀態良好的U266細胞，以5×103/孔接種于96孔板。將細胞隨機分為inhibitor組、inhibitor+si-VDR組和空白對照組，inhibitor組采用Lipofectamine 2000轉染miR-125a-5p inhibitor及si-Con質粒，inhibitor+si-VDR組轉染miR-125a-5p inhibitor及si-VDR質粒，空白對照組轉染miR-NC及si-Con質粒。

1.5.2 細胞增殖能力觀察 ①CCK-8法：三組轉染后0、24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育4 h，使用酶標儀檢測450 nm處的光密度(OD)值。②集落形成實驗：將細胞培養液鋪于 6 孔板，三組按照1.5.1處理并轉染 24 h 后，加入瓊脂培養基，調整細胞密度為 1×104/L，混合均勻后接種于鋪有下層軟瓊脂的 6 孔板中。37 ℃、5% CO2培養箱中培養14 d，每孔加入 200 μL噻唑藍溶液(5 mg/mL)，繼續培養過夜，顯微鏡下觀察集落形成情況，并對集落形成個數進行計數。

2 結果

2.1 U266細胞、人正常骨髓原代細胞miR-125a-5p表達比較 U266細胞、人正常骨髓原代細胞miR-125a-5p相對表達量分別為 2.79±0.65、1，二者比較P<0.01。

2.2 U266細胞、人正常骨髓原代細胞VDR蛋白表達比較 U266細胞、人正常骨髓原代細胞VDR蛋白相對表達量分別為0.27±0.06、1，二者比較P<0.01。

2.3 miR-125a-5p與VDR的雙熒光素酶報告基因檢測結果 轉染VDR-wt+NC質粒、VDR-wt+miR-125a-5p mimic質粒的U266細胞細胞熒光素酶相對活性分別為1.00±0.38、0.23±0.05，二者比較P<0.01；轉染VDR-mut+NC質粒、VDR-mut+miR-125a-5p mimic質粒的U266細胞熒光素酶相對活性分別為1.02±0.03、1.05±0.04，二者比較P>0.05。

2.4 inhibitor組、inhibitor+si-VDR組和空白對照組細胞增殖能力比較 培養48、72 h， inhibitor組、inhibitor+si-VDR組和空白對照組培養相同時間下的OD值均依次升高，組間兩兩比較P均<0.05。見表1。inhibitor組、inhibitor+si-VDR組、空白對照組集落形成個數分別為 (143±25)、(359±38)、(421±11)個，組間兩兩比較P均<0.05。

表1 兩組不同時間點細胞增殖能力比較

3 討論

研究顯示，80%～90%的MM患者可出現溶解性骨損傷、高鈣血癥、病理性骨折和脊髓壓迫綜合征等臨床癥狀，而骨骼系統相關并發癥是導致MM患者死亡的主要原因[8,9]。MM的發病原因至今仍不清楚，現有的研究表明miRNA可能在MM的發生發展過程中發揮重要作用。miRNA是由19～25個堿基組成的短鏈非編碼RNA，其通過誘導靶基因mRNA的降解或抑制翻譯來調節基因表達。miRNA的異常表達與人類癌癥發生密切相關，包括MM[10]。王金行等[11]研究顯示，miR-21可通過下調SPRY2表達而影響MM細胞的增殖和侵襲能力。郁佳佳等[12]研究報道，miR-202可增強MM細胞中B細胞活化因子表達。miR-125a屬于microRNA家族，定位于人類19號染色體上。最近的研究表明，miR-125a-5p在多種癌細胞的增殖、遷移和凋亡過程中發揮關鍵作用。張思毅等[13]報道，miR-125a-5p可抑制喉癌細胞增殖、促進非小細胞肺癌細胞侵襲[14]。但是miR-125a-5p在MM中的作用并不清楚。本研究結果顯示，U266細胞miR-125a-5p表達明顯高于人正常骨髓原代細胞，且inhibitor組細胞增殖能力明顯低于空白對照組；說明U266細胞miR-125a-5p表達升高可促進其細胞增殖能力，證明miR-125a-5p在MM的發生過程中發揮腫瘤促進因子作用。

研究報道，血清維生素D水平降低是導致MM骨骼并發癥發生的重要原因[17]。維生素D除了在維持骨骼動態平衡方面的作用外，還具有腫瘤抑制因子作用， 可抑制腫瘤細胞增殖和血管生成，并促進細胞凋亡[18,19]。趙偉強等[20]報道，MM患者血清維生素D3水平顯著降低[19]。研究發現，VDR在乳腺癌、結腸癌、胃癌等多種腫瘤中表達異常[21,22]，然而VDR在MM 中的報道并不多見。劉英等[23]曾報道VDR在MM患者中發生點突變，提示VDR在MM發生過程中可能具有重要作用。

本研究TargetScan分析結果顯示miR-125a-5p可與VDR序列配對，提示兩者之間可能存在靶向關系。進一步采用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證，結果顯示miR-125a-5p可與VDR結合而抑制熒光素酶活性，證實VDR是miR-125a-5p的作用靶點。本研究結果顯示，U266細胞miR-125a-5p表達明顯高于人正常骨髓原代細胞、VDR蛋白表達明顯低于人正常骨髓原代細胞，證實miR-125a-5p對VDR具有負性調控作用。一項對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型的研究顯示，miR-125a-5p可調節VDR的表達，從而影響多發性硬化的發生和發展[15]；另一項關于肝細胞肝癌的研究結果顯示，miR-125a-5p mimic可抑制肝細胞癌細胞VDR升高及維生素D的抗腫瘤作用[16]。以上結果均表明，miR-125a-5p與VDR之間存在有靶向關系，且二者之間呈負調控關系，與本研究結果一致。本研究結果顯示，inhibitor組、inhibitor+si-VDR組和空白對照組培養48、72 h的OD值以及集落形成個數均依次升高；說明抑制VDR表達可促進U266細胞增殖。因此，U266細胞中miR-125a-5p表達升高，miR-125a-5p可通過負性調控VDR表達而促進細胞增殖。