HPLC法測定新疆地區紅棗中黃酮類物質的含量

袁輝，張煌濤，王建玲

新疆產品質量監督檢驗研究院（烏魯木齊 830011）

紅棗是新疆的一種特產，屬李科棗屬水果，具有補氣養血、養血安神的功效；干果肉厚、皮薄、味甜、無污染的特點。目前，新疆紅棗種植面積和產量已躍居全國第一，成為新疆農業支柱產業之一[1]，新疆紅棗年產量超過3.00×106t，位列各省首位，屬優勢特色農產品[2]。

現代藥理學發現，紅棗含有蛋白質、脂肪、糖類、有機酸、微量元素等豐富的營養成分。研究表明，包括癌癥、冠心病、高血壓、心肌梗塞在內的40余種疾病均與人體內環磷酸腺苷cAMP代謝相關[3]，對心臟起到營養心肌、正性肌力、舒張血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。cAMP在棗中的含量是現在所有已測動植物材料中最高的[4]。紅棗中的黃酮類物質，如蘆丁、槲皮素等，具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、抗病毒活性、抗衰老、增強免疫力等作用，綠原酸具有抗炎[5]、抗病毒[6]的功效。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗材料，新疆各產地紅棗50批次；環磷酸腺苷對照品（東京化成工業株式會社）；蘆丁、槲皮素、綠原酸對照品（德國Dr. Ehretorfer GmbH公司）；甲醇（德國默克公司）；磷酸二氫鉀等均為分析純。

2695高效液相色譜儀（美國WATERS公司）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；SB-800DTD超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5418離心機（德國Eppendorf）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

將紅棗樣品切成細條，放入100 ℃烘箱中烘干，然后粉碎過50目篩，備用。準確稱取2 g（精確至0.000 1 g）粉碎樣品于離心管中，加入一定量的水，超聲提取30 min，冷卻至室溫后用水定容至50 mL。在4 000 r/min下離心10 min，取上清液，過0.22μm濾膜，供環磷酸腺苷待測使用。

準確稱取4 g（精確至0.000 1 g）粉碎樣品于離心管中，加入一定量的30%甲醇水溶液，超聲提取30 min，冷卻至室溫后用30%甲醇水溶液定容至50 mL。在4 000 r/min下離心10 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，供蘆丁、槲皮素和綠原酸待測使用。

1.2.2 標準溶液的配制

準確稱取4種對照品，各0.1 g，定容至100 mL，配制成1 mg/mL的標準儲備液，于4 ℃冷藏避光保存，使用前將環磷酸腺苷儲備液用水稀釋成1～20 μg/mL的標準工作液，蘆丁、槲皮素、綠原酸三種儲備液用30%甲醇水溶液稀釋成0.1～5 μg/mL的混合標準工作液。

1.2.3 色譜條件

環磷酸腺苷測定條件：大連依力特公司ODS-BP色譜柱（5 μm，4.6 mm×200 mm），柱溫為40 ℃，流動相為20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 3）-甲醇（80∶20，V/V），流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，波長為254 nm。

蘆丁、槲皮素、綠原酸測定條件：流動相為20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 3）-甲醇，流速1 mL/min，梯度洗脫，見表1，進樣量為10 μL，波長為325 nm。

圖1 槲皮素、綠原酸、蘆丁、環磷酸腺苷的分子結構圖

表1 HPLC 梯度洗脫程序

1.3 數據處理

通過液相色譜儀相配套的Empower 3色譜數據處理軟件完成相關成數據采集與處理，利用Origin Pro 8.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 線性關系與檢出限

測定質量濃度為1，2，4，10和20 μg/mL的環磷酸腺苷標準溶液，以及質量濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.8和1 μg/mL的蘆丁、槲皮素、綠原酸混合標準溶液，繪制標準曲線，求得線性回歸方程和線性相關系數（R）。相關系數均大于0.999，表明在此濃度范圍內4種待測組分線性關系良好。以3倍信噪比確定方法檢出限（LOD），LOD為0.2～1 mg/kg，結果見表2，對照品和紅棗樣品的色譜圖見圖2。

表2 4種物質的線性回歸方程、線性范圍、相關系數及檢出限

圖2 紅棗的HPLC色譜圖

2.2 測定結果

對50批次紅棗進行測定，得到新疆紅棗中環磷酸腺苷及蘆丁、槲皮素、綠原酸的數據結果，結果見表3。

表3 50批次紅棗測定數據 mg/kg

2.3 回收率與精密度試驗

稱取已知環磷酸腺苷和蘆丁、槲皮素、綠原酸含量的同一紅棗樣品，共18份，參照4種待測組分的方法定量限、樣品平均含量以及最高含量分別添加標準溶液，制備低、中、高3個濃度水平的加標樣品，按照1.2小節制備，并按照規定的色譜條件進行測定，結果見表4。

表4 樣品添加濃度及回收率試驗

2.4 穩定性試驗

取同一樣品處理液，室溫避光保存24 h，隔2 h測定1次，環磷酸腺苷、蘆丁、槲皮素、綠原酸峰面積的RSD分別為0.32%，0.63%，0.85%和0.68%，表明樣品處理液在室溫避光保存條件下24 h內穩定。冷藏避光保存1周，每天測定1次，環磷酸腺苷、蘆丁、槲皮素、綠原酸峰面積的RSD分別為0.58%，0.77%，0.85%和0.56%，表明樣品處理液在冷藏避光保存條件下1周內穩定。蘆丁、綠原酸見光不穩定，光照下色澤變暗，需避光保存。

2.5 重復性試驗

稱取同一紅棗樣品，共6份，按照上述兩個條件進行提取并測定，計算得到環磷酸腺苷的方法RSD，為1.87%，蘆丁、槲皮素、綠原酸的方法RSD為2.31%～2.92%，表明此次試驗中兩種提取方法重復性良好。

2.6 前處理條件的選擇

環磷酸腺苷的樣品提取方法主要有加熱回流提取法[7]、超聲提取法[8]、快速溶劑萃取法[9]等。經比較，采用超聲提取法，具有經濟、快捷的優勢。

蘆丁、槲皮素、綠原酸樣品處理過程中[10-11]，比較100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、10%甲醇和水的處理效果。結果表明，30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇均可達到良好提取效果，當甲醇含量較高時，雜質溶出增加，提取液較混濁，色譜干擾嚴重。最終確定30%甲醇水溶液為提取溶劑。采用此方案還可使甲醇與水的比例和梯度洗脫初始條件下流動相匹配，可避免樣品提取液的洗脫強度高于流動相，產生溶劑效應，造成色譜峰變形，分離度降低。分別考察了10，15，30，45和60 min的超聲提取效果，結果表明，超聲30 min以后，延長提取時間，提取率無明顯增加，故提取時間選擇30 min。

2.7 色譜條件

在測定波長的選擇上，蘆丁最大吸收波長為256 nm，槲皮素最大吸收波長為255 nm，綠原酸最大吸收波長為325 nm，因綠原酸響應值較低，故蘆丁、槲皮素、綠原酸同時檢測時，確定其測定波長325 nm。此波長下，樣液中有吸收響應的雜質較少，因此色譜干擾峰較少，有利于待測物的準確定性定量。由于環磷酸腺苷和多酚類的蘆丁、槲皮素、綠原酸均呈弱酸性，其pKa在5～6之間，因此調整磷酸二氫鉀溶液pH 3，將流動相pH與待測組分pKa相差兩個單位，抑制待測組分電離，使其色譜行為可控，保留時間穩定，保證了色譜分離的重現性。

2.8 新疆紅棗中有效成分含量分析

從50批次不同產品和品種的紅棗測定結果可以看出，新疆各地紅棗中綠原酸的含量為0.44～2.16 mg/kg，平均值為0.88 mg/kg；蘆丁的含量為0～14.86 mg/kg，平均值為4.43 mg/kg；槲皮素的含量為0.38～2.15 mg/kg，平均值為0.96 mg/kg；環磷酸腺苷的含量為50.48～357.28 mg/kg，平均值為190.68 mg/kg。

3 結論

此次試驗建立了高效液相色譜法測定紅棗中環磷酸腺苷及蘆丁、槲皮素、綠原酸的方法，通過提取條件的優化，選擇了經濟、快捷的前處理方法，建立色譜條件。總體上該方法簡單、快速、準確度高、精密度好，完全滿足紅棗中4種成分測定的需求，并對新疆各產地不同品種50批次紅棗進行測定。從結果看，這4種有效物質含量差異較大，說明產地、品種不同，新疆紅棗的品質有較大差異。新疆日照時間長，光熱豐富，降雨少，土質優，以其得天獨厚的地理氣候環境孕育了世界聞名的新疆大棗，如何全面評價新疆紅棗的品質，使新疆的紅棗產業健康、持續、穩定的發展，為紅棗的開發利用提供科學依據，是目前需要認真研究的問題。