維生素U含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展

朱碧云，秦博文，馬霞*

1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院（上海 201418）；2.上海禾文農(nóng)業(yè)科技有限公司（上海 201107）

S-甲基甲硫氨酸（S-methylmethi onine，SMM），也稱維生素U，是一種功能性親水分子，具有α-氨基酸端基的陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)。Cheney等[1]不僅從甘藍(lán)汁中分離出該物質(zhì)，還驗(yàn)證了它對(duì)胃潰瘍的愈合和預(yù)防有益，所以其因潰瘍（Ulcer）一詞得名。顧名思義，維生素U是一種有效的抗?jié)儎?。維生素U不僅具有清除自由基的能力，還具有其他的藥用價(jià)值，例如鎮(zhèn)痛、降血脂、防輻射、明顯提高肝細(xì)胞的谷胱甘肽水平和抑制肝損傷等作用[2-4]。

目前在國(guó)內(nèi)維生素U主要是以一種合成胃藥的形式出現(xiàn)在公眾的視野中，碘甲烷法和氯甲烷法是人工化學(xué)合成維生素U常見的方法[5]。天然維生素U廣泛存在于自然界的植物中，特別是十字花科蕓薹屬植物。由于維生素U的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有雙鍵，造成其具有不穩(wěn)定性的特征，維生素U在酸堿、熱、光等環(huán)境下易分解生成一種風(fēng)味物質(zhì)——二甲基硫醚（圖1），因此其分析測(cè)定都比較困難[6]。由于人工合成維生素U與天然維生素U的測(cè)定方法有所不同，因此對(duì)兩種不同來源的維生素U含量的測(cè)定技術(shù)和方法進(jìn)行總結(jié)，以期為這種特殊的“維生素”的研究和發(fā)展提供理論依據(jù)。

圖1 S-甲基甲硫氨酸（2）在酸堿、熱等條件下降解生成二甲基硫醚（1）反應(yīng)方程

1 藥品中維生素U的測(cè)定方法

維生素U包含兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)：氯化甲基蛋氨酸（C6H14ClNO2S）和碘化甲基蛋氨酸（C6H14INO2S）[7]。維生素U常與氫氧化鋁、三硅酸鎂、顛茄浸膏等組成復(fù)方制劑，用于治療胃潰瘍和十二指腸潰瘍。目前市場(chǎng)上的制劑主要包括復(fù)方維U顛茄鉍鎂片、維U顛茄鋁鎂片和復(fù)方蘆薈維U片等[8]。針對(duì)此類藥品，目前建立的主要分析方法有銀量法、酸堿滴定法、電位滴定法、TLC薄層色譜技術(shù)、柱前衍生-高效液相色譜法。

1.1 滴定法

1.1.1 銀量法

銀量法，是采用硝酸銀（AgNO3）溶液作為滴定劑，測(cè)定能與Ag+反應(yīng)生成難溶性沉淀的一種滴定分析方法[9]。在酸性環(huán)境中，用硫氰酸銨反滴用過量硝酸銀滴定后的供試品，以硫酸鐵銨為指示劑，測(cè)定復(fù)合維生素U制劑中的維生素U含量。每毫升0.1 mol/L硝酸銀（AgNO3）溶液相當(dāng)于19.97 mg的C6H14ClNO2S。在國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中，銀量法最初采用硝基苯試劑來保護(hù)氯化銀沉淀，但硝基苯毒性大且易揮發(fā)。因此彭瑞平[10]采用雙次過濾法，對(duì)原法進(jìn)行了改進(jìn)。定量供試液通過干燥濾紙進(jìn)行二次過濾后再用硫氰酸銨滴定，該法的滴定突躍較原法明顯，又避免了有毒物質(zhì)的添加。該法雖然對(duì)銀量法進(jìn)行了改進(jìn)，但仍存在滴定終點(diǎn)不清晰，難以準(zhǔn)確判別；硫氰酸銨有害健康；實(shí)驗(yàn)操作繁瑣耗時(shí)等缺點(diǎn)。

1.1.2 酸堿滴定法

酸堿滴定法是指利用酸和堿在水中以質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析方法?；莅譡11]針對(duì)維U顛茄鋁膠囊Ⅲ含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)供試液的處理方法進(jìn)行改進(jìn)。該藥在國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中維生素U含量的測(cè)定：將供試品用錘熔玻璃漏斗過濾后，經(jīng)中性甲醛固定，以酚酞為指示劑，用氫氧化鈉（NaOH）滴定液滴定。每毫升氫氧化鈉相當(dāng)于19.97 mg的C6H14ClNO2S。但由于供試品為乳濁狀，很難過濾，改進(jìn)后的方法，是將供試液過濾后再離心取上清液用于滴定。該法耗時(shí)少，由原法的6～10 h縮短為1 h左右，但酸堿滴定法的精密度與準(zhǔn)確性都不高，需要進(jìn)一步的改進(jìn)。

1.1.3 電位滴定法

電位滴定法是一種在滴定過程中通過測(cè)量電位變化以確定突躍指示終點(diǎn)的方法[12]。與傳統(tǒng)指示劑滴定法相比：電位滴定法可用于滴定突躍小或不明顯的滴定反應(yīng)；可避免有色或混濁試樣的干擾；裝置簡(jiǎn)單，操作方便，可自動(dòng)化且精密度和準(zhǔn)確度高。陳莉[13]對(duì)傳統(tǒng)銀量法進(jìn)行改進(jìn)，采用電位滴定法，以硝酸銀（AgNO3）溶液測(cè)定維生素U制劑中的維生素U含量。該方法直接將用純水溶解過濾后的供試品用硝酸銀（AgNO3）溶液進(jìn)行電位滴定，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，避免了各種類型維生素U制劑中的輔料、其他成分以及滴定過程中產(chǎn)生的Ag+沉淀的影響；實(shí)驗(yàn)耗時(shí)少，由原法的2～3 h縮短至30 min左右，大大提高了工作效率；實(shí)驗(yàn)過程中不需要添加硝基苯、硫氰酸銨等有毒試劑，安全環(huán)保。但電位滴定對(duì)儀器的精度要求很高，精度不高，會(huì)對(duì)檢出限有一定的限制，對(duì)某些微量滴定來說，電位滴定法顯得有些力不從心。

1.2 色譜法

1.2.1 TLC薄層色譜技術(shù)

TLC薄層色譜技術(shù)又稱薄板層析技術(shù)，是一種最常見的分離分析方法，屬于固液吸附色譜，其兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)[14]。趙體慧等[15]為了測(cè)定維生素U片中的維生素U含量，建立了基于TLC色譜技術(shù)的快速檢測(cè)方法。該方法以95%的乙醇作為提取溶劑，正丁醇-丙酮-25%～28%氨水-水（40∶40∶8∶25）為流動(dòng)相，微晶纖維素為固定相，同時(shí)以茚三酮為顯色劑，可對(duì)維生素U片中的維生素U進(jìn)行分析和含量測(cè)定。TLC薄層色譜技術(shù)前處理方式簡(jiǎn)單，設(shè)備廉價(jià)，操作方便，但其理論塔板數(shù)較低，分離效率不好且對(duì)生物高分子的分離結(jié)果不甚理想。

1.2.2 柱前衍生-高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是色譜法的一個(gè)重要分支，其以氣相色譜理論為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用小顆粒作為固定相，用高壓泵輸送流動(dòng)相建立而成[16]。因?yàn)榫S生素U的結(jié)構(gòu)中不具有紫外和熒光吸收的基團(tuán)，所以無法直接利用HPLC-UV進(jìn)行檢測(cè)。但由于維生素U分子中含有氨基酸結(jié)構(gòu)，可以利用該特點(diǎn)將氨基酸柱前衍生化后，建立柱前衍生-高效液相色譜法，以提高分析檢測(cè)的靈敏度和分離選擇性[17]。馬經(jīng)明等[18]對(duì)維U顛茄鋁膠囊中維生素U含量測(cè)定的方法進(jìn)行改進(jìn)，根據(jù)維生素U的特殊結(jié)構(gòu)，建立柱前衍生化HPLC檢測(cè)法測(cè)定其含量。以二硝基氟苯（FDNB）為柱前衍生劑，在碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH 10.0）介質(zhì)中進(jìn)行衍生化反應(yīng)，以HPLC法測(cè)定含量。王林鳳[19]通過正交試驗(yàn)對(duì)維U顛茄鋁膠囊的HPLC柱前衍生條件進(jìn)行優(yōu)化，選用二硝基氟苯（DNFB）為柱前衍生劑，最佳衍生條件為：反應(yīng)溫度70 ℃，介質(zhì)pH 10.0，衍生劑DNFB與維生素U的摩爾比1∶3，反應(yīng)時(shí)間 40 min。維生素U的兩種構(gòu)型分別在8～40 μg/mL（r=0.999 2）和12～60 μg/mL（r=0.999 7）濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該法得到的衍生產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，色譜圖中樣品的各成分均達(dá)到基線分離，且色譜行為良好，方法準(zhǔn)確，精密度高、重復(fù)性好，為維U顛茄制劑中維生素U的含量檢測(cè)提供了新方法。但該法操作復(fù)雜，成本較高。

2 食品中維生素U的測(cè)定方法

植物和動(dòng)物中維生素U是由L-甲硫氨酸先轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸，再通過甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的作用合成（圖2）[20]。維生素U是許多代謝途徑的中間體，其合成可降低游離甲硫氨酸及其活性衍生物S-腺苷甲硫氨酸的濃度[21]。測(cè)定食品系統(tǒng)中維生素U的含量，難點(diǎn)在于維生素U在植物和動(dòng)物體內(nèi)代謝的復(fù)雜性和其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。近些年，國(guó)內(nèi)外研究者多將幾種檢測(cè)技術(shù)結(jié)合使用以精確定量測(cè)定維生素U。目前主要的方法是氨基酸分析儀、液相色譜法、質(zhì)譜法等之間的聯(lián)用。

圖2 維生素U在植物體內(nèi)的合成流程

2.1 液相色譜與氨基酸分析儀聯(lián)用

氨基酸分析儀是一種基于陽(yáng)離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測(cè)定的離子交換色譜（IEC）法，它可用于水解氨基酸及游離氨基酸含量的測(cè)定，具有專一性且無需將待測(cè)氨基酸進(jìn)行柱前或柱后衍生的特性[22]。Ueda等[23]僅將西藍(lán)花干燥樣本經(jīng)檸檬酸鋰緩沖液萃取后，直接采用氨基酸分析儀定量測(cè)定西藍(lán)花中的維生素U。該方法簡(jiǎn)便，但精確度低，未考慮維生素U結(jié)構(gòu)的特殊性。Kim[24]使用液相色譜（LC）與氨基酸分析儀聯(lián)用的方法測(cè)定26種食用植物中的維生素U含量，并且通過統(tǒng)計(jì)分析證明食用植物中各種游離氨基酸和維生素U含量水平之間不存在顯著聯(lián)系。該方法較前者分離效果好，具有較高的選擇性和靈敏度。

2.2 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用

液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）是當(dāng)代最重要的分離和鑒定的分析方法之一，為食品和藥物等領(lǐng)域的分析檢測(cè)技術(shù)提供了廣闊的發(fā)展前景[25]。液相色譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其分離效率高、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高、操作自動(dòng)化及應(yīng)用范圍廣；但色譜法的缺點(diǎn)在于其定性能力較差。質(zhì)譜法不僅樣品用量極少，而且能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，但樣品檢測(cè)前需經(jīng)一定的分離、純化處理。為解決這兩種技術(shù)的弱點(diǎn)，經(jīng)過前人不斷的研究，發(fā)展了許多技術(shù)，其中色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)極具發(fā)展和應(yīng)用前景。Scherb等[26]首先開發(fā)利用穩(wěn)定同位素稀釋分析（SIDA）與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法，該方法用氘代碘甲烷標(biāo)記S-甲基甲硫氨酸，以量化食品樣品中的維生素U。SIDA與LC-MS/MS的聯(lián)用技術(shù)被證明具有高選擇性和高敏感性，其回收率為102.5%，平均標(biāo)準(zhǔn)偏差≤6%，表現(xiàn)出了良好的再現(xiàn)性。然而，該方法需要復(fù)雜的提取步驟以及優(yōu)化溫度的時(shí)間，有必要開發(fā)簡(jiǎn)化的提取程序，優(yōu)化維生素U在食品中的定量方法。Morisaki等[27]利用氘代苯-d6作為S-甲基甲硫氨酸的內(nèi)標(biāo)，采用液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)大豆熱處理過程中維生素U含量變化的一個(gè)檢測(cè)。 Song等[28]在對(duì)十字花科家庭蔬菜中的維生素U進(jìn)行測(cè)定時(shí)，采用超高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS/MSn）的方法，其檢出限達(dá)0.488～0.502 μg/mL，準(zhǔn)確度達(dá)98.84%（±4.77%）～109.12%（±2.63%）。該方法更為簡(jiǎn)便快捷，結(jié)合HPLC-MS/MS，提供有關(guān)分子量和多級(jí)質(zhì)量檢測(cè)的重要數(shù)據(jù)，并且可以便于鑒定單個(gè)化合物。Deed等[29]建立了一種液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法與穩(wěn)定同位素稀釋（SIDA）法相串聯(lián)的技術(shù)來測(cè)定葡萄汁和葡萄酒中的維生素U，為釀造工業(yè)中檢測(cè)食用植物的維生素U含量提供了一種更為便捷的方法。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)維生素U的研究還是集中于藥物學(xué)方面，而國(guó)外學(xué)者早在20世紀(jì)就開始對(duì)食品中維生素U的含量進(jìn)行了一定的研究。隨著分析化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的滴定法、薄層色譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)的精確度、選擇性和靈敏度等方面都有一定的制約，液相色譜技術(shù)以及各種高新技術(shù)的串聯(lián)方法也就應(yīng)運(yùn)而生。雖然這些方法操作簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確度高，檢測(cè)限低，但是仍具有設(shè)備昂貴、操作難度較大等劣勢(shì)。因此，研究學(xué)者需要不斷的研究，開發(fā)出更為精準(zhǔn)、快捷、普及性和實(shí)用性高的分析技術(shù)和方法，為維生素U含量的測(cè)定研究提供可行性依據(jù)。