超聲輔助酶解大米多肽對酵母細胞活性及耐凍性的影響

李素云，覃穎泉，謝冬梅，張華，李星科，王語遲

鄭州輕工業大學食品與生物工程學院（鄭州 450002）

冷凍面團技術是應用在面食制品生產的新工藝，因其不僅能延長面食制品的貯藏時間，還能提高面食制品制作的方便和貯藏穩定性，所以發展迅速。但冷凍后的面食制品會出現一定程度的品質變化，這是因為在冷凍過程中，酵母菌細胞內外水分凍結成冰，冰晶生長會破壞酵母細胞膜結構，同時酵母胞內水分變化會發生電解質濃縮效應，影響細胞的生理功能和代謝功能，直接對酵母菌造成機械傷害[1-2]，從而導致冷凍后饅頭體積變小、醒發時間延長等問題，這嚴重制約冷凍面團制品發展[3-4]。因此，對于酵母細胞耐凍性增強和活性保護成為冷凍面團研究的主要問題[5]。

前期研究表明，在相同酶解時間內，超聲輔助酶解的大米多肽（RP）培養基中得到的酵母細胞量比未超聲培養基中得到的酵母細胞量多，證明大米多肽可以促進酵母細胞增殖，且與多肽分子量大小有關。因此試驗以葡萄糖作為碳源，在酵母培養基中用超聲輔助酶解制取的大米多肽、酪蛋白胨及酵母氮源作為氮源進行比較，進一步研究大米多肽對酵母增殖、發酵活性及耐凍性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大米多肽（RP，制備具體參數為：超聲功率密度51.8 W/L、超聲溫度50 ℃、超聲時間15 min；大米蛋白溶液濃度40 g/L，酶添加量[E]/[S]=6%，溶液溫度50 ℃、pH 8.5，酶解100 min后滅酶、上清液凍干）；酪蛋白胨；酵母氮源；葡萄糖（分析純）；安琪干酵母；酵母浸粉；蛋白胨；瓊脂粉。

1.2 主要儀器與設備

離心機；低溫冰箱；可見/紫外分光光度計；立式壓力蒸汽滅菌器；超凈工作臺；生化培養箱；恒溫振蕩器。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基及培養條件的確定

YNB培養基：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB（酵母氮源基礎）、pH 5.5；大米多肽培養基：20 g/L葡萄糖、10～30 g/L RP（大米多肽）、pH 5.5；25 g/L CP培養基：20 g/L葡萄糖、25 g/L CP（酪蛋白胨）、pH 5.5；YPD培養基：10 g/L酵母浸粉、20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨（固體培養基加20 g/L瓊脂粉）。YNB培養基用0.22 μm濾膜過濾除菌，其他培養基121 ℃、15 min高溫高壓滅菌；酵母細胞培養在100 mL培養基中，安琪酵母經2代活化后以1%接種量接菌于培養基，于30 ℃、120 r/min培養24 h。

1.3.2 酵母細胞的收集及濕質量測定

將培養24 h后的菌液分裝到提前稱質量并記錄好質量（m1，g）的50 mL離心管，使用離心機離心得到酵母細胞。離心條件為：轉速4 000 r/min、離心時間10 min。離心后菌液下層沉淀即為所需的酵母細胞，舍去上清液，稱定離心管質量（m2，g），m2與m1的差即為所得酵母細胞的濕質量。

1.3.3 發酵面團制備、發酵過程測定及蒸制

將離心后得到的酵母細胞與42 g去離子水、75 g面粉混合成面團，每份50 g于100 mL相同規格的小燒杯中壓平表面，一份于37 ℃直接發酵，另一份置于-18℃低溫冰箱儲存5 d，取出常溫解凍1 h后37 ℃發酵。面團發酵過程中每隔15 min用直尺測面團高度并記錄，發酵結束后，將發酵面團于沸水入鍋蒸20 min，結束5 min后開鍋取出放涼，從中間切開觀察剖面。

1.3.4 生長曲線的測定

為了解不同氮源培養基對酵母增殖的影響，將經2代活化后的酵母菌液以1%接種量接菌于100 mL培養基中，在30 ℃下以120 r/min搖床培養。分別在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24，27，30，33和36 h時取樣，用可見/紫外分光光度計測定菌液吸光度，測定波長600 nm。以生長時間為橫坐標，菌液吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.5 酵母細胞存活率的測定

培養結束后用稀釋涂布平板法對所得菌液進行平板培養計數，同時將菌液置于-18 ℃低溫冰箱儲存5 d，取出解凍1 h后用同樣的方法進行平板培養計數，得到冷凍前后培養液中酵母細胞濃度，計算存活率。

存活率=lg（冷凍后培養液中酵母細胞濃度）/lg（未冷凍時培養液中酵母細胞濃度）×100% （1）

2 結果與分析

2.1 不同氮源培養基對酵母細胞增殖的影響

由前期研究可知，培養基中添加25 g/L大米多肽可以獲得較好的培養效果。因此以25 g/L氮源濃度研究其對酵母細胞增殖影響，所以試驗培養基濃度均為25 g/L。表1為不同氮源培養基培養酵母細胞離心后得到的酵母細胞濕質量。由表1可知，大米培養基離心后得到的酵母細胞最多，有1.35 g；其次是CP培養基，離心出1.26 g酵母細胞；最后是YNB培養基和空白對照組。從表1的數據可證明大米多肽對于酵母細胞的增殖有促進作用。

表1 不同氮源培養基中得到的酵母濕質量

2.2 不同氮源培養基培養酵母的生長曲線

以25 g/L氮源濃度研究其對酵母細胞培養過程的影響，OD600nm值的大小和菌液中的細胞密度呈正比，具體結果見圖1。結果表明，CP作為氮源的培養基在0～5 h和其他氮源培養基內的酵母數量差別不大，但是于10～24 h菌液的OD600nm值增加比YNB、CP的快，且酵母的對數期時間較長。因此大米多肽作為氮源培養基最終得到更多酵母細胞，證明大米多肽能促進酵母細胞增殖。

圖1 不同氮源培養基中酵母細胞的生長曲線

2.3 大米多肽培養基對面團中酵母細胞發酵活性的影響

在相同大小的燒杯中，通過測量面團的發酵高度的增長表示面團中酵母細胞的發酵力。圖2為3種不同氮源的培養基所得酵母發酵面團高度。

由圖2可知，與CP和YNB培養基中所得酵母細胞發酵的面團能力相比，RP培養基中所得酵母細胞發酵的面團最先達到發酵終點，約120 min，且此時面團增長高度約是YNB面團的1.02倍、CP面團的1.7倍，表明以大米多肽作為培養基氮源培養酵母細胞在面團中具有更好發酵力。

對于冷凍面團，由圖2可以看出，大米多肽培養基面團能更快進入發酵狀態，發酵力保持仍然很好，210 min時大米多肽培養基面團增長高度約是YNB培養基面團的2.9倍，是CP培養基面團的9.6倍。因此大米多肽培養得到的酵母細胞在冷凍后的發酵面團中也能夠較好地保持發酵力。

圖2 不同氮源培養所得酵母發酵面團高度

圖3 是不同時間面團發酵的照片記錄，可看到60 min時各個面團的發酵程度相差比較明顯，未冷凍的發酵面團隨發酵的進行高度差距逐漸減小，而以大米多肽作為培養基培養的酵母添加到面團冷凍后發酵高度始終明顯高于其他兩種面團。結合圖2，冷凍后面團發酵過程中的高度變化表明，冷凍后大米多肽培養基培養的酵母細胞在面團中能夠保持較高的發酵力，用大米多肽作為培養基氮源培養酵母細胞在面團冷凍過程中發酵力的損失較少。發酵結束面團蒸制后切面照片如圖4所示。對于未經冷凍的面團蒸制的饅頭，大米多肽培養基饅頭內部氣孔細密均勻；CP培養基、YNB培養基和空白組饅頭內部氣孔相較之下不夠均勻，存在較多大氣孔。對于面團冷凍5 d后蒸制的饅頭，大米多肽饅頭內部氣孔與未經凍藏相比變化較小，但CP、YNB培養基和空白組饅頭內部氣孔都變小很多，表示相應發酵力很小。

2.4 發酵面團中添加大米多肽方式對酵母細胞發酵活性的影響

大米多肽作為培養基氮源來培養酵母細胞添加在普通面團和冷凍面團中均有顯著效果，將大米多肽直接添加到面團中進行發酵，發酵面團的高度變化曲線如圖5所示。大米多肽直接添加到面粉里進行發酵，在初始階段發酵力比大米蛋白作為培養基的效果要好，但是120 min后大米蛋白作為培養基的效果要好于直接添加到面粉里的，同時冷凍后的面團具有相同趨勢。原因有可能是多肽作為培養基氮源培養得到更多酵母細胞，同時這些酵母細胞還具有更好的耐凍性，研究結果與Izawa等[6]相同。

圖3 冷凍和未冷凍面團在不同發酵時間的照片記錄（從左到右為RP，CP，YNB）

圖4 發酵結束蒸制后的照片記錄

圖5 發酵面團中添加大米多肽方式對酵母細胞發酵活性的影響

2.5 不同氮源培養對酵母細胞耐凍性的影響

為探究大米多肽對酵母細胞耐凍性的影響，不同培養基中酵母細胞冷凍前后的細胞存活率如圖6所示。RP培養基里的酵母存活率最高，YNB次之，CP培養基里的酵母存活率最低。大米多肽培養基培養的酵母細胞冷凍后存活率明顯高于CP培養基培養的酵母細胞，比CP培養基里的酵母細胞存活率高約34.58%，表明大米多肽對增強酵母細胞的耐凍性有一定影響，可減少冷凍導致的細胞失活。

圖6 冷凍前后不同培養基中的酵母細胞存活率

3 結果與討論

用不同的培養基培養酵母細胞對酵母細胞的增殖、發酵活力及耐凍性有不同影響。由試驗可得到如下結論：

1) 大米多肽對于酵母細胞的增殖有促進作用。大米多肽、CP和YNB這3種培養基中，大米多肽培養基培養的酵母細胞增殖最多。

2) 與酵母氮源及酪蛋白胨相比，以大米多肽作為氮源的培養基培養酵母，在普通發酵面團及冷凍發酵面團中具有更好的發酵力。

3) 在面團中直接添加大米多肽對普通發酵面團及冷凍發酵面團都沒有顯著的效果，因此大米多肽對于酵母細胞增殖影響主要作用在酵母細胞的培養過程而不是發酵過程。

大米多肽在酵母細胞的培養過程中，促進酵母細胞的增殖，使酵母細胞的耐凍性增強，改善了冷凍面團的發酵性能。大米多肽作為一種本身可食用的功能性營養物質應用于培養基，與基因手段等方法相比更加簡便高效且安全，應用于酵母細胞制備和冷凍面團中也更容易被消費者所接受，能擴大大米多肽的應用范圍。