熒光PCR技術應用于芥辣調味品原料真偽鑒別

何永盛，連曉聰，花振新，羅北照，馮美紅

精益和泰質量檢測股份有限公司（廣州 510700）

芥辣調味品以其獨特的風味與口感，成為了生鮮山葵和辣根都是制作芥辣調味產品的常用原料，然而兩者在經濟價值上卻存在著較大的差異。山葵又名山萮菜，原產于日本，是一種營養豐富的食用保健植物，具有免疫調節、抗菌、抗氧化等多種藥理作用，在國際市場上的需求很大，價格也較為昂貴[3]。辣根雖然與山葵同屬十字花科植物，但價格卻只有山葵的五分之一左右，而且具有易栽種、生長周期短等優勢，因此被很多商家作為山葵的“代替品”來使用[4]。

在實際生產過程中，商家為了節約成本，往往會在辣根泥中加入色素進行調色，以此作為原料制作Wasabi等芥辣調味品[5]。加工后的辣根調味料與山葵調味料在形態上較為相似，難以通過外觀及味道上的細微差別來鑒定其原料屬性。由于山葵與辣根原料在價格上存在較大的差異，不法商家為了獲取高額的利潤，有可能以低價的辣根來冒充山葵原料制作芥辣調味品，這種摻偽造假的行為侵犯了消費者的知情權，也對其經濟利益造成了一定的損失。

目前，山葵和辣根原料的鑒定仍缺乏有效的技術手段，雖然有學者嘗試分析兩者的化學成分，但由于山葵和辣根的主要風味成分都是異硫氰酸酯類物質，所以也難以通過此類方法進行準確的鑒別[6-8]。與此相比，由于熒光PCR技術具有快速、準確且不受樣品形態限制等優點，近年來在動植物原料成分鑒定研究方面得到了越來越廣泛的應用[9-11]，因此研究擬借助此技術建立可以用于鑒別山葵和辣根成分的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山葵、辣根以及用于方法驗證的多種動植物材料和芥辣調味品均購自當地超市或網絡平臺。

熒光定量PCR儀（型號：7500），美國ABI公司；超微量核酸蛋白測定儀（型號：Q5000），美國Quawell公司；高速冷凍離心機，德國Wiggens公司。

DNA提取試劑盒（DNeasy mericon Food Kit），德國QIAGEN公司產品；PCR預混液2×premix ExTaq，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成

選取山葵和辣根各自的特異性基因，通過與NCBI數據庫中的其他物種序列進行比對，分別設計相應的檢測引物和探針，序列如表1所示。試驗中所用引物和探針均委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成，各引物和探針在使用前統一用滅菌去離子水稀釋至10 μmol/L。

表1 山葵和辣根檢測引物及探針

1.2.2 樣品DNA的提取

采用QIAGEN公司的DNeasy mericon Food Kit，對購買的山葵和辣根樣品以及其他用于方法特異性驗證的樣品進行DNA提取，操作方法見其使用說明書。各樣品基因組DNA在上機測試前統一稀釋至25 ng/μL。

1.2.3 PCR反應體系及程序

山葵檢測反應體系：總體積為20 μL，其中2×premix ExTaq為10 μL，引物SK-Forward和SK-Reverse各0.4 μL，探針SK-Probe為0.2 μL，樣品DNA為2 μL，滅菌去離子水為7 μL。

辣根檢測反應體系：總體積為20 μL，其中2×premix ExTaq為10 μL，引物LG-Forward和LG-Reverse各0.4 μL，探針LG-Probe為0.2 μL，樣品DNA為2 μL，滅菌去離子水為7 μL。

山葵和辣根檢測反應的程序均為：95 ℃時1 min；95 ℃時15 s，60 ℃時1 min，40個循環。

1.2.4 結果判定

在山葵檢測反應中，若待測樣品的Ct值＜35，則可判定樣品中含有山葵成分；若Ct值≥35，則可判定樣品中未檢出山葵成分。

在辣根檢測反應中，若待測樣品的Ct值＜35，則可判定樣品中含有辣根成分；若Ct值≥35，則可判定樣品中未檢出辣根成分。

1.2.5 方法特異性驗證

選取大米、大豆、豬肉、羅氏蝦等不同的動植物樣品作為檢測對象，分別使用山葵和辣根特異性引物及探針進行熒光PCR擴增，以驗證所建立方法的檢測特異性。

1.2.6 方法靈敏度測試

設置兩個試驗組：在試驗組1中將濃度同為25 ng/μL的山葵DNA和辣根DNA按1∶1 000的比例進行均勻混合，以此作為待測樣品，加入到山葵檢測反應體系中進行熒光PCR擴增；在試驗組2中將濃度同為25 ng/μL的山葵DNA和辣根DNA按1 000∶1的比例進行均勻混合，以此作為待測樣品，加入到辣根檢測反應體系中進行熒光PCR擴增。

1.2.7 樣品檢測

在網絡平臺和商場購買不同品牌的芥辣調味產品，提取各樣品的基因組DNA，用建立的檢測方法鑒別其是否含有山葵和辣根成分，以驗證該方法在實際樣品檢測中的適用性。

2 結果與分析

2.1 山葵和辣根檢測反應體系擴增結果

在山葵檢測反應體系中加入50 ng的山葵DNA，同時在辣根檢測反應體系中加入50 ng的辣根DNA，按照前述的反應程序進行熒光PCR擴增，檢測結果如圖1所示。結果顯示，山葵和辣根樣品的DNA在各自的檢測反應體系中都出現了典型的擴增曲線，且Ct值＜35，說明研究建立的檢測方法可以有效地鑒別山葵和辣根成分。

圖1 山葵和辣根樣品的熒光PCR擴增結果

2.2 方法的特異性試驗結果

以購買的山葵、辣根以及其他19種動植物樣品對方法的特異性進行檢驗，從表2的試驗結果可以看出，研究建立的山葵成分檢測方法僅對山葵樣品有特異性擴增，同時辣根成分檢測方法僅對辣根樣品有特異性擴增，而其他19種樣品在兩種反應體系中均未檢出山葵或辣根成分，說明研究建立的方法具有良好的特異性。

表2 方法特異性試驗結果

2.3 方法靈敏度測試結果

以25 ng/μL的山葵DNA和25 ng/μL的辣根DNA為母液，分別按照1∶1 000和1 000∶1的比例制作混合樣品DNA，以此作為方法靈敏度的測試樣品，分別用于山葵和辣根反應體系的擴增。圖2的試驗結果顯示，體積濃度為0.1%的山葵DNA和辣根DNA可以分別在山葵反應體系和辣根反應體系中擴增出典型的曲線，且Ct值＜35，說明研究建立的山葵和辣根檢測方法的靈敏度均可達到0.1%。

圖2 山葵和辣根檢測方法的靈敏度試驗結果

2.4 樣品檢測結果

在當地市場和網絡平臺上購買7批次芥辣調味品，用建立的山葵和辣根成分檢測方法對各批次樣品進行檢測，并將所得結果與產品標示的原料成分進行對比。表3的結果顯示，研究建立的實時熒光PCR方法能夠適用于市售芥辣調味品的實際檢測，其中有6批次樣品的檢測結果與產品標標的原料成分一致，但有1批次樣品出現了與產品標示原料成分不一致的情況，說明商家可能對此產品進行了摻偽造假。

表3 市售芥辣調味品的檢測結果

3 結論與討論

研究建立的實時熒光PCR檢測方法能夠準確鑒別芥辣調味品中的山葵和辣根原料成分。在對市售芥辣調味品的檢測中，發現確實有商家利用低價的辣根原料冒充山葵原料的情況出現，因此該方法的建立可以為有關部門對芥辣調味產品原料真偽情況的監督提供有力的技術支持。此外，研究建立的方法仍有進一步改良的空間，比如可以通過優化PCR體系，建立在一個反應中同時鑒別山葵和辣根成分的雙重實時熒光PCR檢測方法等，有待在后續的研究中加以完善。