響應面法優化苜蓿蛋白酶解工藝

李偉民，陳九杰，魏泉增，張瑩麗

許昌學院食品與生物工程學院，河南省食品安全生物標識快檢技術重點實驗室（許昌 461000）

紫花苜蓿在中國各地均有種植[1]。苜蓿（Medicago sativa）中蛋白質含量可達22%以上，含有的氨基酸種類多樣[2]。大多數直接提取的葉蛋白很難被直接利用，而且苜蓿蛋白具有很強的抗原性，表現為較低的消化率和生物效價[3]，這使得苜蓿蛋白產業的發展受到一定阻礙。

苜蓿蛋白經過酶法水解后制備的多肽對人體具有重要作用，多肽是涉及人體內多種細胞功能的重要物質，對于預防心腦血管疾病、促進造血功能、調節內分泌與神經系統等[4]方面疾病，多肽類藥物具有明顯效果[5]。多肽不僅可提高物質的利用價值，還可賦予物質一定生物學活性，特別是在增強抑菌性[6]、免疫性[7]和抗氧化性[8]等方面。已發現的多肽主要有降血壓、促進免疫功能、抑菌等[9]多種功能。

近年來，多肽的制備多選用核桃[10]、海參[11]、魚籽[12]等原料，而這些原材料通常價格昂貴，不易獲取。試驗采用苜蓿為原材料，苜蓿易獲得，經濟價值低，種質資源豐富。目前對苜蓿多肽的制備方法的研究較少。試驗利用中性蛋白酶對苜蓿進行酶解制備多肽，以提高苜蓿的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花苜蓿；中性蛋白酶（酶活力20萬 U/g，南寧龐博生物工程有限公司）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FA2014B分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；TG16-WS離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；T6課件分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Dk-8D水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；PHS-3C型pH計（上海佑科儀器儀表有限公司）；DL-1型電爐（中興偉業儀器有限公司）；750t型粉碎機（鶴壁市天冠儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 多肽溶液制備方法

準確稱取一定量的苜蓿粉于反應容器中，依照蛋白酶添加量加入中性蛋白酶溶液，調整到預設pH，緩慢攪拌，酶解過程中注意維持酶解系統pH恒定。酶解結束后將酶液迅速置于沸水中滅酶10 min。冷卻至室溫后，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.2 標準曲線繪制

溶液中多肽含量測定方法采用雙縮脲法[13]。標準曲線制備方式見表1。在試管中加入一定酪蛋白溶液，其中不足1 mL的用蒸餾水補至1 mL，以1.0 mL蒸餾水為空白，向各試管中加入4 mL雙縮脲試劑，充分混勻，室溫下反應30 min，用721分光光度計在540 nm處測其吸光度，繪制標準曲線。

表1 蛋白標準曲線制備

1.3.3 多肽濃度測定

將收集到的上清液定容至100 mL，搖勻，移取10 mL溶液至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，使上清液澄清，吸取1 mL上清液，并和4 mL雙縮脲試劑混合，以蒸餾水為空白，室溫下溶液反應30 min，測定吸光度。最后根據標準曲線關系式，計算溶液濃度。

1.3.4 單因素試驗

確定中性蛋白酶添加量（1 500，2 250，3 000，3 750和4 500 U/g）、酶解溫度（40，45，50，55和60℃）、酶解時間（2，3，4，5和6 h）和酶解pH（pH 5，6，7，8和9 h）4個因素，分別考察其對溶液中多肽含量的影響。

1.3.5 響應面試驗

在單因素試驗結果探索最適酶解時間、最適酶解pH、最適酶解溫度、最適中性蛋白添加量的基礎上，選取其中的酶解時間、酶解pH、酶解溫度作響應面綜合分析。采用Design-Expert 8.0.6軟件中心組合試驗進行多肽含量提取最佳工藝。試驗方案見表2。

表2 試驗因素和水平

1.4 數據分析

響應面試驗結果利用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析，建立回歸方程并作等高線和三維曲面圖，對任意2種因素的交互效應進行分析和評價，得到最優工藝組合。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白標準曲線

以酪蛋白含量為橫坐標，OD值為縱坐標，制作標準曲線，從而得到回歸方程：y=0.043 5x+0.000 9，相關系數R2=0.999 9。

圖1 蛋白標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 中性蛋白酶添加量對酶解效果的影響

中性蛋白酶添加量對酶解效果的影響如圖2所示。苜蓿在中性蛋白酶添加量1 500 U/g時，多肽含量最低，隨著中性蛋白酶添加量增加，水解度不斷增大。中性蛋白酶添加量3 750 U/g時，多肽含量最高，隨著中性蛋白酶量繼續增加，多肽含量降低。酶濃度過高，酶分子間可能相互水解，導致酶解效果下降[14]。

圖2 中性蛋白酶添加量對苜蓿多肽含量的影響

2.2.2 酶解溫度對酶解效果的影響

酶解溫度對酶解效果的影響如圖3所示，溶液中多肽含量呈現先緩慢上升后逐漸下降趨勢。溫度40 ℃時，苜蓿多肽含量較低。在一定范圍內，溶液中多肽含量與酶解溫度呈正相關。溫度達到50 ℃時，苜蓿多肽含量最高，隨后繼續增大溫度，多肽含量開始下降，溫度達到60 ℃時，苜蓿多肽含量最低，溫度偏高或偏低均會抑制中性蛋白酶的活性，溫度過高會導致中性蛋白酶逐漸失活，影響酶解效果，酶解溫度以50℃為宜。

2.2.3 酶解時間對酶解效果的影響

酶解時間對酶解效果的影響如圖4所示。苜蓿在酶解2 h條件下多肽含量最低，隨著時間增加，苜蓿多肽含量隨之增加。苜蓿在酶解時間4 h時多肽含量最大。隨著酶解時間繼續增加，苜蓿多肽含量下降，水浴時間6 h時，苜蓿多肽含量最低，這可能是由于隨著酶解時間延長，短鏈的多肽片段被繼續水解為氨基酸[15]。酶解最適時間以4 h為宜。

圖3 酶解溫度對苜蓿多肽含量的影響

圖4 酶解時間對苜蓿多肽含量的影響

2.2.4 酶解pH對酶解效果的影響

酶解pH對酶解效果的影響如圖5所示。苜蓿在pH 5條件下多肽含量最小。在一定范圍內，酶解pH與苜蓿多肽含量呈正相關。苜蓿多肽在酶解pH 7時多肽含量為最大值，隨著pH逐漸增大，苜蓿多肽含量開始下降。苜蓿在酶解pH 9條件下多肽含量最低。酶解最適pH為7。

圖5 酶解pH對苜蓿多肽含量的影響

2.3 響應面法優化

2.3.1 響應面法試驗分析及結果

由4個單因素結果選取其中的酶解時間（A）、酶解pH（B）、酶解溫度（C）這3個因素作為參考依據，以多肽含量為指標。進行響應面試驗，確定中性蛋白酶水解制備苜蓿多肽的最佳工藝條件。響應面試驗方案及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

2.3.2 方差分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件進行數據分析，建立多元二次響應面回歸模型為：R=6.78-0.043-0.010B-0.20C-0.17AB+0.25AC+0.012BC-0.65A2-0.51B2-0.39C2。由表4可以看出，模型達到極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），表明方程無失擬性因素存在，回歸模型與實際值能較好地擬合。一次項A表現為顯著，B、C表現為極顯著，二次項A2、B2、C2表現為極顯著，說明它們對響應值影響極大。由F檢驗可以得到影響因素主次排序：酶解溫度（C）、酶解pH（B）和酶解時間（C）。

表4 回歸分析結果

圖6直觀反映不同兩因素之間的交互作用對多肽含量的影響，曲面越彎曲，兩因素交互作用對多肽含量的影響越顯著。由表4可知，其中因素AB、AC對多肽含量的影響顯著（p＜0.01），BC對多肽含量的影響不顯著（p＞0.05）。

圖6 不同兩因素之間交互作用對酶解液中多肽含量的影響

2.3.3 苜蓿蛋白酶解工藝的確定及優化工藝條件驗證

經Box-Behnken試驗設計，Design-Export 8.0.6軟件分析得出最優條件：酶解pH 6.88、時間4.10 h、溫度49.94 ℃。此條件下酶解液中多肽含量為6.778 8 mg/mL。將工藝參數調整為：酶解時間4.1 h、溫度49.9 ℃、pH 6.88。在此工藝條件下測定的多肽含量為6.752 1 mg/mL。與預測值的相對誤差0.39%，比較接近。試驗可證明模型可靠，方程能較真實反映各因素對多肽含量影響的實際情況。

3 結論

試驗為利用中國苜蓿蛋白資源、提高苜蓿附加值，在單因素基礎上，進行響應面試驗對苜蓿蛋白酶解工藝進行優化，苜蓿多肽制備的最優條件為：加酶量3 750 U/g、酶解pH 6.88、酶解溫度49.9 ℃、酶解時間4.1 h。在此條件下，測得溶液中多肽的含量最高，達到6.752 1 mg/mL，與預測值兩者之間的相對誤差為0.39%，通過軟件建造的模型也能真實直觀反映情況，模型與實際情況貼近吻合，響應面的數據處理真實有效，具有實際使用價值，為苜蓿進一步開發利用提供理論依據。