復合酶法提取革胡子鯰下腳料中的磷脂酰膽堿的工藝

劉雪凌，林貝，周學材

燕京理工學院（三河 065201）

從魚下腳料中提取磷脂酰膽堿的方法有溶劑萃取法、無機鹽沉淀法、酶解法等。其中酶解法屬于較為安全高效的方法，酶在多因素作用下可以極大地影響酶解速率，因此在單一酶解法的基礎上探究復合酶法提取磷脂酰膽堿的工藝能帶來更好的經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯉魚下腳料，山東榮信水產食品集團股份有限公司提供；中性蛋白酶（生化試劑），南京奧多福尼生物科技有限公司；胰蛋白酶（生化試劑），上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（生化試劑），天津市化學試劑批發公司；磷酸二氫鉀（分析純），天津市北辰方正試劑廠；鉬酸銨（分析純），上海埃彼化學試劑有限公司；對苯二酚（分析純），天津市北方天醫化學試劑廠；硫酸（分析純），深圳市慶茂化工有限公司；乙酸鈉（分析純），天津市致遠化學試劑有限公司；乙酸（分析純），濟寧恒泰化工有限公司；無水乙醇（分析純），天津市恒興化學試劑有限公司；EDTA（分析純），天津大茂化學試劑廠；氯化鈉（分析純），天津市福成化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

FA1004B電子分析天平，上海佑科儀器有限公司；JJ-2組織搗碎機，金壇市萬華實驗儀器廠；pH計，煙臺凱米斯儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UV-1601紫外分光光度計，北京北分瑞利分析儀器（集團）公司。

1.3 試驗方法[1]

1.3.1 試驗技術路線

3 g魚下腳料→復合酶酶解→加入乙醇提取→磷脂酰膽堿提取液→鉬藍比色法測磷含量

其中，鉬藍比色法按GB/T 5537—2008進行。

1.3.2 復合酶法提取工藝的研究

影響復合酶（主要組分為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶及激活劑）法提取魚下腳料中磷脂酰膽堿的主要因素有酶添加量、酶解pH、酶解時間、酶解溫度和激活劑。通過單因素試驗和正交試驗，確定最佳復合酶酶解法提取磷脂酰膽堿的工藝。

2 結果與討論

2.1 影響三種蛋白酶提取魚下腳料中磷脂酰膽堿的因素

2.1.1 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的添加量對磷脂酰膽堿提取的影響

根據之前研究確定木瓜蛋白酶的最佳添加量為0.04%；胰蛋白酶的最佳添加量為0.015%[2-3]。從圖1可以看出，當pH為7.5，溫度為45 ℃，向魚下腳料中添加中性蛋白酶的酶量[添加量=（m酶/m原料）× 100%]為0，0.015%，0.020%，0.025%，0.030%，0.035%，0.04%，0.045%和0.05%，酶解時間為60 min時，提取率隨三種蛋白酶添加量的增加先是增加然后下降，胰蛋白酶的提取效果最好，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶近似，中性蛋白酶的最適添加量為0.030%。原因可能是酶解產物過多，抑制酶解過程，降低了提取率，還可能是酶屬于蛋白質，酶超出適宜量后彼此相互作用影響，降低了提取率。

圖1 酶添加量對磷脂酰膽堿提取的影響

2.1.2 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的酶解pH對磷脂酰膽堿提取的影響

根據之前研究確定木瓜蛋白酶的最佳酶解pH為7；胰蛋白酶的最佳酶解pH為9[2-3]。從圖2可以看出，當溫度為45 ℃，酶解時間為60 min，酶解pH分別設定為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0時，三種蛋白酶對磷脂酰膽堿的提取率均為上升而后下降，酶解pH過高和過低均會影響提取效果。木瓜蛋白酶提取效果最好，中性蛋白酶提取效果次之，其最佳提取pH為7.5。

2.1.3 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的酶解時間對磷脂酰膽堿提取的影響

根據之前研究確定木瓜蛋白酶的最佳酶解時間為100 min；胰蛋白酶的最佳酶解時間為80 min。從圖3可以看出，當酶解時間為40，50，60，70，80和100 min時，三種蛋白酶對磷脂酰膽堿的提取率的變化規律一致，都是先上升而后下降。此時，中性蛋白酶的提取效果最好，木瓜蛋白酶次之，中性蛋白酶的最佳酶解時間為80 min。

圖2 酶解pH對磷脂酰膽堿提取的影響

圖3 酶解時間對磷脂酰膽堿提取的影響

2.1.4 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的酶解溫度對磷脂酰膽堿提取的影響

根據之前研究可確定木瓜蛋白酶的最佳酶解溫度為50 ℃；胰蛋白酶的最佳酶解溫度為37 ℃[2-3]。從圖4可以看出，當酶解溫度為25，30，35，40，45，50，55和60 ℃時，隨著酶解溫度的升高，提取率先升高后降低。其中中性蛋白酶提取效果最好，木瓜蛋白酶次之，此時，中性蛋白酶的最佳酶解溫度為45 ℃。溫度過高，酶容易變性，磷脂酰膽堿也容易分解。

圖4 酶解溫度對磷脂酰膽堿提取的影響

2.1.5 NaCl和EDTA分別作為激活劑對三種蛋白酶提取磷脂酰膽堿的影響比較

從圖5和圖6可以看出，當NaCl和EDTA分別作為激活劑并分別添加0.08%時，在三種蛋白酶進行提取時，都是NaCl的激活效果最好。在圖6中，當NaCl的加入量從0，0.04%，0.08%，0.12%和0.16%變化到0.2%時，添加量0.12%時的提取率最高。NaCl沒有毒性，價錢便宜，少量添加后，對蛋白酶有激活作用，可以增加提取率。

圖5 激活劑對磷脂酰膽堿提取的影響

圖6 NaCl的添加量對磷脂酰膽堿提取的影響

2.2 用復合酶解法提取革胡子鯰下腳料中磷脂酰膽堿的最佳工藝確定

在單因素試驗的基礎上，用乙醇作提取溶劑，對A木瓜蛋白酶添加量（0.035%，0.040%和0.045%）、B胰蛋白酶添加量（0.012 5%，0.015 0%和0.017 5%）、C中性蛋白酶添加量（0.025%，0.030%和0.035%）、D氯化鈉添加量（0.12%，0.16%和0.20%）、E酶解pH（7.0，7.5和9.0）這5個因素在3個水平上進行優選，采用L18(35)進行正交試驗，提取溫度為45 ℃，結果見表1。

由表1可知，中性蛋白酶對試驗影響最大，木瓜蛋白酶次之，pH的影響也不容忽略，激活劑增加了酶解效率，而胰蛋白酶對試驗影響不大，根據各組正交試驗結果可得各組優水平，進而選出最佳的復合酶法工藝配方為A2B2C3D3E2，即木瓜蛋白酶添加量為0.04%，添加中性蛋白酶0.03%，胰蛋白酶添加量為0.017 5%，標準氯化鈉溶液添加0.20%，pH為7.5。此配方通過使用價格更為低廉的氯化鈉溶液，減少了各種酶的用量，不僅減少了經濟開銷，還增加了提取效率，同時配方的pH溫和，對儀器要求不高，損耗也不大。

表1 正交試驗結果

pH 7.5時，三種單一酶的最佳添加量和復合酶最佳添加量條件下進行對比試驗，其提取率比較見表2。由表2可以看出，復合酶的提取率遠遠高于單一酶。

表2 單一酶解法和復合酶解法的比較

3 結論

通過復合酶法從鯉魚下腳料中提取磷脂酰膽堿所做的平行試驗和正交試驗，經過分析，可得到如下結論：

1) pH 7.5時，三種單一酶的最佳添加量和復合酶最佳添加量條件下做對比試驗，可得復合酶的提取率遠遠高于單一酶。

2) 通過五因素三水平的正交試驗，得到復合酶解法提取革胡子鯰下腳料中磷脂酰膽堿的最佳工藝，即木瓜蛋白酶添加量為0.04%，添加中性蛋白酶0.03%，胰蛋白酶添加量為0.017 5%，標準氯化鈉溶液添加0.20%，pH為7.5。

3) 該項目的主要三廢為廢液和廢渣，沒有廢氣。廢渣主要是魚的內臟及魚骨殘渣與酶渣，殘渣干燥處理可以用作動物飼料；廢液主要成分為乙醇和水，通過精餾塔精餾把水和乙醇分離，而乙醇可以循環利用，節約成本。