竹蟲蛋白的堿法提取及功能性質(zhì)測定

張芮嬌，朱靜靜，劉紹芳，高斌，馮勵

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（昆明 650201）

竹蟲又稱為竹蛆，是螟蛾科（Pyralidae）禾草螟屬（Chilo）的昆蟲，竹蟲的食用蟲態(tài)為幼蟲，主要分布于云南省的西雙版納州、德宏州、紅河州等地區(qū)，是云南當?shù)鬲毦咛厣拿褡迨称防ハx[1-2]。

國內(nèi)對竹蟲的研究較少，關(guān)于竹蟲蛋白的提取及其功能性質(zhì)的研究鮮見報道。馮穎等對竹蟲的營養(yǎng)進行分析，并且對其開發(fā)價值進行評述，分析表明，竹蟲蛋白含量30%～40%，粗脂肪含量60.42%、氨基酸含量29.9%、不飽和脂肪酸含量55.9%，營養(yǎng)豐富[3]。國外較早對竹蟲進行深入研究[4]，研究內(nèi)容涉及生物學(xué)特性、滯育解除及生理生化等方面。

人類對昆蟲蛋白資源的價值認識越來越深入，對其開發(fā)利用也逐漸重視，昆蟲蛋白可能成為人類在21世紀重要的新蛋白資源，所以對竹蟲蛋白的提取及研究具有重大意義[5-7]。試驗通過堿提酸沉法提取竹蟲蛋白，探究其功能性質(zhì)，為竹蟲蛋白的研究提供理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)，也為竹蟲蛋白應(yīng)用于保健食品及生物活性制劑等開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹蟲（云南省西雙版納州市售）；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、濃硫酸硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、考馬斯亮藍等（昆明傲雪商務(wù)有限公司）。

SHZ-82恒溫振蕩器（金壇市大地自動化儀器廠）；UV-6100S紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；PHS-3C pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；FD-1A-50冷凍干燥機（上海比朗儀器制造有限公司）；EPED-ESL-10TH實驗室級超純水器（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 竹蟲預(yù)處理工藝流程

竹蟲洗凈→液氮粉碎→自然風(fēng)干→乙醚脫脂（1∶30）→自然風(fēng)干→脫脂竹蟲粉→密封保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 竹蟲蛋白提取

1.2.2.1 工藝流程[8-9]

脫脂竹蟲粉→堿法提取→離心（4 000 r/min，20 min）→酸沉（調(diào)pH至等電點）→靜置→離心（4 000 r/min，20 min）→冷凍干燥→竹蟲粗蛋白

1.2.2.2 蛋白提取方法

通過凱氏定氮法測定竹蟲蛋白含量[10-14]。

式中：c為鹽酸標準溶液濃度，mol/L；V1為滴定樣品吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積，mL；V2為滴定空白吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；M為1/2 N2的摩爾質(zhì)量，14.01 g/mol；F為氮換算為蛋白的系數(shù)。

利用考馬斯亮藍法測定提取液中的蛋白含量[15]，蛋白質(zhì)提取率計算如式（2）。

式中：M1為樣品中蛋白含量，g；M0為提取液中蛋白含量，g。

以牛血清蛋白含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性方程為：y=5.381 7x+0.111 3（R2=0.999 3）。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

固定提取溫度40 ℃、時間90 min、料液比1∶30 g/mL，考察不同濃度（0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mol/L）的NaOH溶液對竹蟲蛋白提取率的影響；固定提取溫度40 ℃，NaOH溶液濃度1.0 mol/L、料液比1∶30 g/mL，探討不同提取時間（30，60，90，120和150 min）對竹蟲蛋白提取率的影響；固定提取溫度40 ℃、時間90 min、NaOH溶液濃度1.0 mol/L，探討不同料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL）對蛋白提取率的影響；固定NaOH溶液濃度1.0 mol/L、時間90 min、料液比1∶30 g/mL，探討不同提取溫度（20，30，40，50和60 ℃）對竹蟲蛋白提取率的影響。

1.2.4 竹蟲蛋白的提取工藝優(yōu)化

以單因素試驗為基礎(chǔ)，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，對竹蟲蛋白的提取工藝進行優(yōu)化[17-20]。優(yōu)化分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計表

1.2.5 竹蟲蛋白等電點的測定

將堿性的竹蟲蛋白提取也調(diào)節(jié)至pH 3.8，4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0和5.2，靜置2 h，在4 000 r/min條件下離心20 min后測提取液中蛋白的含量，提取液中所殘留的蛋白含量最低時的pH即為蛋白的等電點。

1.2.6 竹蟲蛋白功能性質(zhì)的測定

參照參考文獻，稍做修改，進行竹蟲蛋白溶解度[21]、吸水性、吸油性、起泡性和起泡穩(wěn)定性[22]，乳化及乳化穩(wěn)定性的測定[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及處理，利用Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料竹蟲蛋白測定結(jié)果

采用凱氏定氮法，測得原料竹蟲蛋白含量318 mg/g，蛋白含量達31.8%，結(jié)果與文獻[1]中報道的含量基本一致。

2.2 竹蟲蛋白等電點的測定

竹蟲蛋白的等電點測試見圖1。不同pH竹蟲蛋白沉淀后，蛋白在pH 4.4時沉淀最多，上清液中蛋白殘留率最低，說明竹蟲蛋白的等電點為pH 4.4。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 NaOH溶液濃度對竹蟲蛋白提取率的影響

不同NaOH溶液濃度對竹蟲蛋白提取率的影響結(jié)果如圖2所示。蛋白提取率隨NaOH溶液濃度增加先呈上升趨勢，NaOH溶液濃度達到1 mol/L時，蛋白提取率達到最高，為69.47%，而后呈現(xiàn)下降趨勢。有研究表明，NaOH溶液濃度過高會使蛋白變性，導(dǎo)致蛋白提取率降低[24]。因此，選取NaOH溶液濃度1 mol/L。

圖1 蛋白等電點的測定

圖2 NaOH溶液濃度對蛋白提取率的影響

2.3.2 提取時間對竹蟲蛋白提取率的影響

不同提取時間對竹蟲蛋白提取率的影響結(jié)果如圖3所示。蛋白的提取率隨提取時間增加先呈上升趨勢，提取時間達到60 min時，蛋白提取率達到最高，為69.86%，隨著時間延長呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選取60 min為最優(yōu)提取時間。

圖3 提取時間對蛋白提取率的影響

2.3.3 料液比對竹蟲蛋白提取率的影響

不同料液比對竹蟲蛋白提取率的影響結(jié)果如圖4所示。蛋白提取率隨料液比增加先呈上升趨勢，料液比為1∶30 g/mL時，蛋白提取率達到最高，為75.47%，隨著料液比增加呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選取料液比1∶30 g/mL。

2.3.4 提取溫度對竹蟲蛋白提取率的影響

不同提取溫度對竹蟲蛋白提取率的影響結(jié)果如圖5所示。

蛋白的提取率隨提取溫度的增加先呈上升趨勢，提取溫度達到50 ℃時，蛋白提取率達到最高，為74.11%，隨著溫度上升呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選取提取溫度為50 ℃。

圖4 料液比對蛋白提取率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化與結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)優(yōu)化及結(jié)果

竹蟲蛋白提取率響應(yīng)面分析的試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

2.4.2 模型的建立及顯著性的檢驗

通過對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，得到竹蟲蛋白的提取率與各變量的二次方程模型為：Y=63.3+7.55A+7.12B+4.65C+2.24D-1.07AB+2.37AC+2.3AD+1.38BC+2.08BD+0.21CD-3.79A2-1.02B2-1.59C2-4.17D2。

對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。根據(jù)表3中的方差分析可知，模型的p＜0.000 1，表明該模型極顯著，而失擬項的p=0.468 2＞0.05，失擬項不顯著，并且模型的決定系數(shù)R2=0.99，信噪比Adeq precisior=41.59，說明模型與實際試驗有較好擬合度，可信度較高，可用來預(yù)測和分析竹蟲蛋白的提取工藝。離散系數(shù)C.V值為1.71%，C.V值越小，表示試驗可信度越高。

從表3中可以看出，一次項A、B、C、D和二次項A2、B2、C2、D2，以及交互項AC、AD、BC、BD的p值均小于0.01，說明其對蛋白的提取率影響是極顯著的；交互項AB、CD的p值均大于0.05，說明其對蛋白提取率的影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析表

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

通過響應(yīng)面的變化情況直觀反各參數(shù)之間的交互作用對竹蟲蛋白提取率的影響。

由圖6可知，變量兩兩交互時，保持其中的兩個變量不變，隨著另外變量增加，竹蟲蛋白提取率呈先上升趨勢，當達到一定值時又呈下降趨勢，綜合響應(yīng)面圖由圖6（a）、（b）可看出NaOH溶液濃度變化坡度更加陡峭，說明NaOH溶液濃度較料液比和溫度對竹蟲蛋白提取率的影響更顯著；圖6（c）可看出料液比變化的坡度更加陡峭，說明料液比較時間對竹蟲蛋白提取率的影響更顯著；圖6（d）可看出蛋白提取率隨時間變化的坡度更加陡峭，說明時間較溫度對竹蟲蛋白提取率的影響更顯著，與方差分析結(jié)果相符。

2.4.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

最佳條件的確定和回歸模型的驗證，結(jié)果見表4。

通過響應(yīng)面分析得到竹蟲蛋白提取率的最優(yōu)工藝條件為：NaOH溶液濃度1 mol/L，時間60 min，料液比1∶31.67 g/mL，溫度50 ℃。考慮實際操作情況與設(shè)備參數(shù)狀況，確定竹蟲蛋白提取率的最優(yōu)工藝條件為：NaOH溶液濃度1 mol/L，時間60 min，料液比為1∶30 g/mL，溫度為50 ℃。蛋白提取率預(yù)測值為77.45%。在最佳工藝條件下進行驗證試驗，得到蛋白提取率為76.14%，與理論結(jié)果接近，試驗誤差較小。

圖6 提取率的交互作用

表4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

2.5 竹蟲蛋白功能性質(zhì)的測定結(jié)果

蛋白質(zhì)制品在食品工業(yè)中可作為蛋白類添加劑等用于食品的開發(fā)和運用，其應(yīng)用性能取決于其功能特性，試驗對竹蟲蛋白的溶解性、吸水性，吸油性，起泡性、乳化性等進行研究。研究表明竹蟲蛋白在溶液5%、pH 7.0的中性條件下其功能性質(zhì)最穩(wěn)定[25]，測定結(jié)果如表5所示。

表5 竹蟲蛋白功能性質(zhì)測定結(jié)果

根據(jù)有關(guān)對不同蛋白的功能性質(zhì)研究報道，從表5可以看出，竹蟲蛋白的溶解度、吸水性、吸油性、起泡性和起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性均比較良好[26-27]，可利用其吸水性，吸油性等進行食品的開發(fā)及運用，將其作為一類蛋白質(zhì)類添加劑，保證食品的口感和風(fēng)味，對食品工業(yè)發(fā)展具有很大潛在價值。

3 結(jié)論

通過堿提酸沉法提取竹蟲蛋白在響應(yīng)面基礎(chǔ)上，直觀分析各因素對竹蟲蛋白的提取率的影響及在提取過程中各因素的交互作用的影響。結(jié)果表明，各個提取條件對竹蟲蛋白提取率的影響次序為：NaOH溶液濃度＞料液比＞時間＞溫度。在1 mol/L NaOH溶液、料液比1∶30 g/mL、溫度50 ℃、浸提60 min條件下得到竹蟲蛋白的提取率為76.14%，此時竹蟲蛋白的溶解度為23.11%±0.28%，吸水性為312.4%±0.8%，吸油性為372.27%±1.71%，起泡性為127.33%±3.06%，起泡穩(wěn)定性為87.47%±1.25%，乳化性為52.87%±0.49%，乳化穩(wěn)定性為35.37%±0.38%。說明竹蟲具有潛在利用價值，對其進行開發(fā)利用，可帶來較大的經(jīng)濟效益及社會效益。