響應面法優化低共熔溶劑提取桑葉DNJ

王璐，許路路，陳雄，趙宇明，韓靜

沈陽藥科大學（本溪 117004）

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ），可以抑制α-葡萄糖苷酶活性、降低血糖、抑制病毒活性、抑制腫瘤轉移、還可以與胰島素連用增加其敏感度[1]。DNJ的來源分為植物和微生物，桑的枝、葉、根中DNJ含量在已知動植物中最高[2]。雖然DNJ化學合成的方法很多，但是存在操作復雜，產率低，污染大等問題，中國桑葉資源豐富，絲綢產業下滑，桑葉資源利用不充分，所以桑葉中DNJ提取分離純化十分緊迫。

低共熔溶劑[3]（DES）定義為特定摩爾比的氫鍵受體和氫鍵供體形成的均一、澄清、透明的液體，為2種或多種組分的混合物。DES作為一類新出現的溶劑，它的優點有原料普遍、價錢合理、操作簡便、不必純化等。它被廣泛應用在化學合成、氣體吸收、藥物緩釋、催化、提取、電化學等領域[4-6]，在天然產物提取中的應用有人參皂苷、花色素、石蒜科生物堿[7-9]。因此，可針對提取物體的性質選出最適合的DES溶劑，循環利用，以節約成本，減少污染[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉（遼寧本溪農戶提供，中藥學院袁丹教授鑒定為藥桑（Morus nigra L.））；1-脫氧野尻霉素標準品（純度98.9%，上海新鉑化學技術有限公司）；乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl，阜陽曼林生物技術有限公司）；氯化膽堿、甘油（分析純，天津市富寧精細化工有限公司）。

1.2 儀器與設備

Scientz IID超聲細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；L-2130高效液相色譜儀（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

稱取桑葉粉末1.0 g，按料液比1∶20（g/mL）加入低共熔溶劑（含水量50%），在40 ℃，150 W，使用超聲細胞破碎機提取1 次，時間10 min，提取液以10 000 r/min離心15 min，抽濾，少量水潤洗濾渣，獲得桑葉DNJ提取液。

1.3.2 DNJ檢測方法

1.3.2.1 樣品的衍生化處理

精密稱取DNJ標準品2.0 mg，用0.05 mol/L鹽酸定容于10 mL容量瓶，取70 μL的DNJ的標準品溶液或樣品溶液與338 μL濃度為0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH 8.5）混合，加入500 μL濃度5 mol/L氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl溶于50%乙腈溶液），25 ℃水浴20 min，加入50 μL濃度1 mol/L甘氨酸，25 ℃水浴5 min終止反應，加入1%乙酸132 μL及超純水324 μL[10]，渦旋混勻，過0.45 μm濾膜收集待測。

1.3.2.2 色譜條件

高效液相色譜（HPLC）檢測，色譜柱Supersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：乙腈-0.1%乙酸水溶液（40∶60，V/V）。檢測器紫外波長254 nm；進樣量10 μL；流速1.0 mL/min；柱溫25℃，桑葉DNJ提取液進樣。

1.3.2.3 標準曲線建立

將DNJ標準品配制成梯度濃度溶液（14.28，20，40，60，80和100 μg/mL），衍生化處理后進行HPLC測定。以標準品質量濃度x對峰面積y進行線性回歸繪制標準曲線，得到回歸方程y=1 371.2x+3 478.4，R2=0.999 2，在14.28～100 μg/mL范圍內質量濃度與峰面積呈現良好的線性關系。

1.3.2.4 桑葉DNJ提取量的計算

桑葉DNJ提取量計算如式（1）。

式中：X為根據標準曲線計算的提取液的質量濃度，μg/mL；V0為桑葉DNJ提取液體積，mL；M為桑葉樣品質量，g。

1.3.3 DES種類的篩選

1.3.3.1 DES的種類（參見表1）

表1 DES種類

1.3.3.2 DES的制備

按照摩爾比將氫鍵供體和氫鍵受體混合，在65 ℃水浴鍋中加熱約30 min，充分攪拌混勻，得到澄清、透明、微黏稠的液體狀溶劑，在10 000 r/min的轉速下離心10 min，無固體析出，按照比例加入去離子水，制成DES備用。

1.3.4 單因素試驗

按照1.3.1的方法，分別對氯化膽堿甘油摩爾比（2∶1，1∶1，1∶2，1∶3和1∶4）、超聲時間取（10，20，30，40，50和60 min）、DES含水量（10%，20%，30%，40%和50%）3個因素進行考察，得到其對DNJ提取效果的影響，每組重復3次。

1.3.5 Box-Behnken試驗設計

對單因素進行分析，將氯化膽堿甘油摩爾比、低共熔溶劑含水量、超聲時間這3個因素作為Box-Behnken的自變量，響應值為桑葉DNJ提取量，用響應面法進行分析優化，三因素三水平響應面具體數據見表2。

2 結果與分析

2.1 DES種類的篩選

由圖1可知，總體上，氯化膽堿制備成的低共熔溶劑對DNJ的提取優于甜菜堿，DESs-1氯化膽堿與甘油制備DES提取桑葉中的DNJ效果最好。

圖1 DES的種類對提取的影響

2.2 單因素試驗

2.2.1 氯化膽堿與甘油摩爾比對提取效果的影響

一般而言，大多數DES黏度隨溫度升高和氫鍵供體增多，黏度減小[11]。由圖2可看出，氯化膽堿與甘油摩爾比1∶3時提取量最多，氯化膽堿量低時，可能形成較少的分子內氫鍵，并且黏度很大，不利于與桑葉粉末充接觸，隨著甘油的增多，黏度下降，提取量增加，但是摩爾比1∶4時，提取量下降，可能是形成的低共熔溶劑不穩定，氫鍵減少所造成。因此，摩爾比1∶3更有利于DNJ的提取。

2.2.2 超聲時間對提取效果的影響

由圖3可得出，DNJ的提取量隨時間的延長而增大，30 min時，提取值最大，含量逐漸降低。這可能是因為長時間提取，桑葉粉充分吸收提取溶劑，黏稠度增加，過濾困難，過濾出的桑葉體積減少。

2.2.3 DES含水量對提取效果的影響

室溫下的DES的高黏度限制其應用，加水降低黏度，增加傳質速度，提高提取產率[12]，由圖4可看出，隨著溶劑中含水量逐漸增大，DNJ提取量的波動在40%時達到最大，可能是由于分子間的氫鍵比較多，黏度比較適合DNJ溶出，含水量50%時，提取效率降低，可能是過量的水會導致現有氫鍵的損失，破壞DES的特殊結構[13]。含水量30%時，提取量比較低，這種現象可能是因為DNJ類化合物與DES相互作用形成聚合物，或者因為DES的穩定性下降[14]。

圖2 氯化膽堿與甘油摩爾比對DNJ提取量的影響

圖3 超聲時間比對DNJ提取量的影響

圖4 DES含水量對DNJ提取量的影響

2.3 響應面試驗

根據單因素的分析結果，按照響應面的試驗方法，選擇氯化膽堿甘油摩爾比、含水量、超聲時間進行三因素三水平的響應面分析方法。

優化桑葉DNJ的最佳提取條件，結果見表3，使用Design-Expert 10對試驗結果進行擬合，得到DNJ提取量對氯化膽堿甘油摩爾比（A）、含水量（B）、超聲時間（C）數學回歸模型：Y=-2.3+0.6A+0.11B+0.04C+0.000 25AB+0.003 7AC+0.000 071BC-0.11A2-0.000 14B2-0.000 85C2。

表3 響應面設計及結果

由表4可知，二次回歸分析模型p＜0.000 1顯著性良好，失擬項大于0.5不顯著，決定系數R2=0.999 5，校正決定系數R2adj=0.998 8，證明實測值與模型預測值之間具有良好的擬合性，模型可用于分析影響DNJ的提取量的因素。

表4 回歸模型和方差分析

2.4 響應面分析

超聲細胞破碎機輔助提取桑葉DNJ的響應面見圖5。固定1個變量，隨著另一個變量的增加，DNJ提取量先增加達到最大值后下降，含水量（B）和超聲時間（C）、氯化膽堿甘油摩爾比（A）和超聲時間（C）的平面圖呈橢圓形，表明兩者的交互作用明顯。

圖5 各因素及其交互作用對超聲輔助提取影響的響應面

2.5 驗證試驗

由模型可以看出，桑葉DNJ的超聲細胞破碎機輔助提取工藝最優條件為：氯化膽堿甘油摩爾比1∶3.34，含水量40.445%，超聲時間31.74 min。該條件下提取含量為1.447 mg/g，為減少實際操作的繁瑣復雜，將氯化膽堿甘油摩爾比、含水量和超聲時間調整為1∶3.4、40%和32 min。進行3次平行試驗，桑葉DNJ平均提取量為1.445±0.001 8 mg/g，與理論值1.447 mg/g接近。證明模型擬合結果良好，優化的工藝條件可靠，對實際生產有幫助。

3 結論

桑葉DNJ的最佳條件為：氯化膽堿甘油摩爾比1∶3.4，含水量40%，超聲時間32 min，重復3次。此時DNJ平均提取量為1.445±0.001 8 mg/g，與理論值1.447 mg/g接近。DES提取提高了桑葉中DNJ提取量，并且DES制備簡單、可循環利用、生物降解性良好，還可增加提取物穩定性，延長保存時間，為桑葉提取開發利用和天然產物的提取純化保存提供思路。