云南西北部地區家畜無形體感染的分子流行病學調查

姚明國，江佳富，高子厚，賈 娜，湯 麗，何志海，張 青，張 云，王 帆，杜春紅

無形體屬 (Anaplasma spp.)為革蘭染色陰性細胞內專性寄生菌。該菌主要侵染人與動物的血細胞，并以包涵體的形式在宿主細胞胞漿中繁殖。無形體屬目前包括嗜吞噬細胞無形體(A.phagocytophilum)、綿羊無形體(A.ovis)、邊緣無形體(A.mar ginale)、血小板無形體(A.pl atys)、牛無形體(A.bovis)、中央無形體(A.centr ale)和山羊無形體(A.capr a)7種[1-2]。已確認能感染人的有嗜吞噬細胞無形體、山羊無形體和綿羊無形體3種[3-5]。人無形體病主要臨床癥狀有發熱伴白細胞、血小板減少和多臟器功能損害，治療不及時可導致死亡[6-7];而嗜吞噬細胞無形體感染的家畜可出現不規則發熱、貧血、體重減輕甚至死亡。綿羊無形體、邊緣無形體和中央無形體主要侵犯反芻動物的紅細胞，受其感染的動物可出現發熱、貧血、黃疸和體重減輕;牛無形體主要感染牛，引起牛無漿體病[8];血小板無形體主要引起犬血小板減少癥[9]。云南西北部地區地處我國西南邊陲，與緬甸、老撾和越南3國交界，由高黎貢山、怒山、云嶺等高大山脈和怒江、瀾滄江、金沙江等江河流域形成的世界著名的“三江并流”縱谷地景觀組成。該地區大山交匯，垂直高差顯著，立體氣候非常明顯，動植物種類異常豐富，復雜的地形地貌和氣候條件孕育了媒介生物高度多樣性從而形成蟲媒傳染病的高發區[10-11]。養殖業是云南省大部分山區發展經濟的主要產業，且家畜養殖多以放牧為主。既往研究表明，該地區家畜存在嗜吞噬細胞無形體、牛無形體等多種無形體感染的情況，但缺乏系統性的調查研究[12-13]。為了解該地區家畜無形體感染的情況，本研究采用分子生物學方法，對該地區家畜感染情況進行調查，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 在云南省西北部地區的15個縣、市采集家畜血液1 791份，其中牛血555份，羊血630份，犬血556份，馬血33份，驢血17份。采樣區分布見圖1。用一次性真空采血針和無菌EDTA抗凝管采集家畜靜脈血，編號后冷藏保存，帶回實驗室進行檢測。

圖1 云南省家畜樣本調查采樣點分布圖Fig.1 Distribution of domestic sampling area in Yunnan Province

1.2 試劑與設備 血液基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN Geno mic DNA Kit)、Drea mTaq Green PCR Master Mix(2×)(Ther mo Fisher Scientific)、DL2000 DNA Mar ker、凝膠成像儀(Syngene)、PCR擴增儀(SENSO，Lab Cycler Gradient Fuses型)、水平電泳槽(JY-SPFT型)。

1.3 檢測方法

1.3.1 DNA提取 取200μL抗凝血液，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.2 PCR基因擴增 采用半巢式PCR方法擴增無形體16S r RNA基因660 bp片段。引物為Ehout1(5′-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3′)、3-17pan (5′-TAAGGTGGTAATCCAGC-3′)和 Eh-out2(5′-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3′)[14]。

反應條件:第一輪擴增(Eh-out1/3-17pan，1 500 bp):預變性95℃、3 min，變性95℃、30 s，退火55℃、40 s，延伸72 ℃、45 s，終延伸72℃、7 min。第二輪(Eh-out1/Eh-out2，660bp):預變性95℃、3 min，變性95℃、30 s，退火57℃、40 s，延伸72℃、45 s，終延伸72℃、1 min。均為35個循環。

1.3.3 序列測定與分析 擴增產物經凝膠電泳成像，將出現約660 bp條帶的PCR產物送上海(生工)生物工程有限公司進行測序，利用Seq Man軟件將所得序列進行拼接。登錄美國國家生物技術信息中心(NCBI)站點，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具將測序結果與Gen Bank中注冊基因序列進行同源性比對，進行無形體種的確定。應用MEGA6.06軟件，鄰接法N-J構建系統發育樹。將調查數據與實驗數據整理后，運用SPSS 19.0軟件對其進行統計學分析。

2 結 果

2.1 PCR擴增結果 PCR擴增共檢出陽性條帶586份，經測序成功并序列比對為無形體的樣本共503份，另外83份主要為測序失敗28份、埃立克體36份、非特異擴增雜菌19份。部分樣本電泳結果見圖2。

圖2 部分家畜樣本的PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Results of PCR amplified products electrophoresis in some blood samples

2.2 不同地區不同家畜無形體檢測結果 PCR擴增共檢出陽性條帶586份，經測序成功并序列比對為無形體的樣本共503份，其中牛、羊和犬的陽性率分別為 41.08%(228/555)、38.10%(240/630)和6.29%(35/556)，馬和驢中均未檢出任何無形體(表1)。測定擴增陽性片段的DNA序列，將獲得序列做同源性比對，發現其中73株序列(14.51%)屬嗜吞噬細胞無形體，226株序列(44.93%)屬綿羊無形體，137株序列(27.24%)屬邊緣無形體，48株序列(9.54%)屬血小板無形體，16株序列(3.18%)屬牛無形體，3株序列(0.60%)屬山羊無形體。其中牛樣本檢出6種無形體，以邊緣無形體為主(75/228);羊樣本檢出5種無形體，以綿羊無形體為主(216/240)，但未檢測到山羊無形體;犬血僅檢出嗜吞噬細胞無形體。經統計分析，不同家畜樣本檢出無形體基因的陽性率差異有統計學意義(P＜0.001)，陽性率最高的是牛、其次是羊，犬最低，馬和驢未檢測到。15個縣市中有12個縣市的家畜樣本檢出無形體基因，主要分布在德欽縣、香格里拉縣、盈江縣、騰沖市等縣市，德欽縣、香格里拉縣和騰沖市檢出的無形體種類最為豐富(表1、表2)。以盈江縣的牛的樣本陽性率最高(95.65%)，牛以邊緣無形體為主。

表1 云南西北部地區家畜血液樣本的無形體PCR檢測結果Tab.1 Sample infor mation and test result

表1 (續)

表2 不同地區家畜血液樣本無形體PCR檢測結果Tab.2 Result of Anaplasms in domestic in different area 單位:(頭)

2.3 檢出的無形體序列分析 將PCR擴增出16Sr RNA基因序列分別與Gen Bank中注冊的核苷酸序列進行同源性比較，其分別與6種無形體16Sr RNA基因序列的同源性＞98%，以立氏立克次體(Rickettsia rickettsii，DQ150682.1)16Sr RNA基因序列為外群構建系統發育樹(圖3)。不同地區檢出的嗜吞噬細胞無形體16Sr RNA基因序列的同源性在96.8%～100%，種間差異較大分為幾個小分枝。在香格里拉綿羊和黃牛檢出的基因序列(TCB-7、TC-B-188)與韓國人血分離到的嗜吞噬細胞無形體菌株16Sr RNA基因序列(MH482862.1)的同源性為99.77%，僅有2個堿基的差異。從香格里拉和德欽的牦牛或黃牛樣本中檢出3株山羊無形體基因序列的同源性＞98.8%，但卻分別處相鄰小分枝。其中DQ-B-15與中國浙江蜱檢出的中國株16S r RNA基因序列(KR261020.1)的同源性為99%，與中國黑龍江省患者血液分離株16Sr RNA基因序列(K M206275)的同源性為98.25%。羊和黃牛樣本中檢出48株血小板無形體序列，其同源性為97.9%～100%，其中YJ-B-80與哥斯達黎加株(KY389143.1)、菲律賓株(JQ8947792.2)和中國株(KU586031.1)的16S r RNA基因序列100%同源。在牛、羊中檢出16株牛無形體16Sr RNA基因序列的同源性為97.6%～99.8%，與湖北山羊株、韓國蜱株聚在同一分枝，HP-B-3與俄羅斯株(KC484563.1)16Sr RNA基因序列完全一致。檢出的所有邊緣無形體16S r RNA基因序列的同源性為98%～100%，與南非、菲律賓等地的羊和蜱株聚為一群。

系統發育進化分析表明，云南省西北部地區家畜樣本中檢測到的無形體分布在6個無形體種群中，包括嗜吞噬細胞無形體、綿羊無形體、邊緣無形體、血小板無形體、牛無形體、山羊無形體。但TCB-6、YJ-B-76株不能與同源性較高的同種無形體聚在同一個分枝(圖3)。

圖3 基于無形體16Sr RNA基因660 bp片段構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 660 bp fragment of 16Sr RNA gene

3 討 論

本研究以云南省西北部地區的牛、羊、犬、馬和驢為主要調查對象，應用分子生物學的方法，了解這些與人類密切接觸的家畜感染無形體病的情況，為家畜無形體病的防治提供參考，為人感染無形體病的風險進行評估。調查共在15個縣(市)采集1 791份血樣，以當地家庭養殖的主要動物牛、羊、犬為主，共檢出503頭/只動物感染了6種無形體，牛、羊和犬的感染率分別為41.08%、37.97%、6.29%。在采集到羊血樣本的11個縣(市)，除盈江縣外均存在自然感染，而盈江縣可能因樣本量太小(僅5份)有關，羊共感染了除山羊無形體外的5種無形體，以綿羊無形體為主。在6個縣(市)采集了牛血樣本，全部縣市均存在自然感染無形體的情況，種類達6種;5個縣(市)采集的犬血樣本僅德欽縣的犬存在感染嗜吞噬細胞無形體。其中盈江、華坪、云龍等縣家畜檢出無形體的陽性率較高，如盈江縣的牛檢出率高達96.56%，而香格里拉、騰沖和德欽等縣市檢出無形體的種類最多。尤其是對人致病的嗜吞噬細胞無形體和山羊無形體主要分布在滇西北的德欽、香格里拉、騰沖地區。通過16S r RNA基因序列分析，牛、羊、犬檢出的嗜吞噬細胞無形體16S r RNA基因序列同源性為97.5%～100%，在香格里拉綿羊、黃牛和犬樣本中檢出的基因序列與從韓國人血分離到的菌株的16Sr RNA基因序列(MH482862.1)同源性高達99.77%。嗜吞噬細胞無形體可以感染人，引起人粒細胞無形體病(HGA)，硬蜱、血蜱、扇頭蜱等多種蜱類可作為傳播媒介，主要宿主為野生哺乳動物，包括美洲野牛、白尾鹿、狼、牛、羊、犬、馬和兔等[14]。1994年美國報道了首例HGA病例，之后相繼在北美洲、澳洲、歐洲、亞洲等地發現HGA，且感染人數和確診病例呈逐年上升的趨勢[15-16]。2006年我國報道首例實驗室確診HGA病例[14]，此后在山東、浙江、江蘇、黑龍江、新疆等地先后檢測到嗜吞噬細胞無形體核酸和/或抗體[17-19]。而山羊無形體是我國學者于2015年發現的人獸共患新病原體[5]。本次在德欽和香格里拉的牛樣本中檢出相應基因片段，兩地牛血中檢出的序列同源性為98.7%，其序列與中國黑龍江省患者血液分離的山羊無形體16S r RNA基因序列(K M206275)的同源性為98.25%，牛存在山羊無形體感染的情況值得關注。同時，本次調查在3份羊血中檢出牛無形體、10份牛血中檢出綿羊無形體的情況，一般認為牛無形體是感染牛、綿羊無形體感染羊，該結果需作進一步檢測驗證。

云南省西北部地區是我國生物多樣性較高的地區之一，動植物物種極為豐富。尤其近年來隨著天然林保護工程的實施，森林植被逐漸恢復，野生動物也隨之增加。在經濟相對落后的山區，發展養殖業成為山區群眾脫貧的一種重要的方式。由于自然資源優良，牛、羊多進行放養，在滇西北高原還進行冬季和夏季牧場交替放牧的情況，家犬隨主人和牧群轉場，活動范圍更廣。而云南是我國蜱種最豐富的地區，據報道蜱種達46種之多[20]。野外放牧使得一些在野生動物體表寄生的蜱，寄生到家畜和家犬，同時進行疾病的傳播，給人類健康和畜牧業發展帶來危害。本次從30頭牛、8頭羊、35只犬樣本中檢出嗜吞噬細胞無形體、3頭牛中檢出山羊無形體，且基因序列相互同源性較高，與對人致病株的同源性也高，提示滇西北地區可能存在該疾病自然疫源地，犬感染傳播給人類的風險更大，下一步需加強當地人群和蜱蟲感染狀況調查。同時，其它無形體感染，在不同程度上也會對養殖業帶來危害，影響家畜繁殖、肉質產量和質量。因此，在發展養殖業的同時，需開展健康教育宣傳工作，提高個人的防護意識，避免被蜱蟲叮咬，加強家養動物的管理，如定期對動物圈舍、動物體表滅蜱等寄生蟲，促進經濟發展的同時保障人、畜健康。