2010－2018年安徽省馬鞍山市腹瀉患者中非傷寒沙門菌的分子分型與耐藥性研究

洪 穎，王 利，陳 謹，王 蓉，羅 穎，楊 晨，陳道利，柳 燕

非傷寒沙門菌是指除傷寒和副傷寒以外的各種沙門菌，是一種常見的人獸共患傳染性疾病的病原菌，也是感染性腹瀉的重要病原菌。一項非傷寒沙門菌疾病負擔報告顯示，全球每年有9 400萬人因沙門菌患病，15.5萬人死亡[1]。據歐洲食品安全管理局(Efsa)報道，2016年歐盟超過9.4萬例感染是由非傷寒沙門菌引起的[2]。在我國由非傷寒沙門菌引起的食物中毒事件多年來居細菌性食物中毒首位[3]。非傷寒沙門菌血清型構成和優勢型別存在一定的地域特異性[4]，而不同血清型非傷寒沙門菌的耐藥性也存在顯著不同[5]，因此，非傷寒沙門菌的血清分型及耐藥性研究對臨床研究和疾病防控都有著十分重要的意義。隨著分子生物技術的發展，對非傷寒沙門菌的監測也進入了分子水平，PFGE技術是一種非常有效的追蹤感染源的分子分型方法，在流行病學調查、食源性疾病監測和溯源等工作中均發揮著重要作用[6]。

基于馬鞍山區域腹瀉人群中非傷寒沙門菌的感染狀況、流行特征、血清型分布和分子分型等基線數據庫尚未建立，為了解本地區非傷寒沙門菌的流行狀況和病原學特征，現對2010－2018年來源腹瀉患者的非傷寒沙門菌進行血清學分型PFGE分型和耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇馬鞍山市二院、四院、中心醫院和當涂縣醫院4家定點醫院作為腹瀉監測哨點，收集2010－2018年以腹瀉癥狀為主訴、每日腹瀉≥3次、糞便性狀異常的感染性腹瀉病例標本共2 998份，同時收集病例基本信息和流行病學史;標本置于Carry-Blair培養基中冷藏運送。

1.2 主要試劑與儀器 SBG增菌液(美國BD)，沙門顯色培養基(英國OXOID)，克氏雙糖瓊脂(KIA)培養基(英國 OXOID)，SS培養基(英國 OXOID)，XLD培養基(美國BD)，XbaⅠ酶(美國 New England Biolabs)，蛋白酶 K(美國 Amresco)，Sea Ke m Gol d瓊脂糖(美國Lonza)，Gel Red染料(美國Biotiu m)，診斷血清(丹麥SSI)，藥敏檢測板(上海星佰)，CHEF MAPPER型脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio-Rad)，Gel Doc XR＋凝膠成像系統(美國 Bio-Rad)，VITEK 2 compact全自動細菌生化鑒定儀(法國 梅里埃)，菌液比濁儀(美國Ther mo fisher)。

1.3 方 法

1.3.1 分離與鑒定 將糞便標本保存液接種至SBG增菌液，36℃培養18 h，然后分別接種于沙門顯色培養基、SS培養基和XLD培養基，36℃培養24 h。從中挑取數個可疑菌落接種于克氏雙糖瓊脂，36℃培養24 h。可疑菌落用VITEK2全自動生化鑒定儀進行菌種鑒定。鑒定為沙門菌的菌株依據文獻[7]確定血清型別。

1.3.2 PFGE分型 按照Pulse Net China“沙門菌PFGE標準操作程序”操作，以沙門標準菌株H9812作為PFGE分子量標準，選用Xba I酶37℃酶切3 h，電泳19 h，電泳液溫度14℃。電泳結束后用Gel Red對膠塊進行染色，去離子水洗脫。Bio-Rad凝膠成像系統拍照，Bio Nu merics7.6軟件進行聚類分析。

1.3.3 藥敏試驗 按照革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板說明書操作，參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI-2018)標準對結果進行判讀。試驗使用的抗生素有氨芐西林(A MP)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢西丁(CFX)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、氨曲南(AZM)、亞胺培南(I MI)、美羅培南(MEM)、氨芐西林/舒巴坦(A MS)、阿莫西林/克拉維酸(A MC)、四環素(TET)、多西環素(DOX)、米諾環素(MIN)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(A MI)、卡那霉素(KAN)、鏈霉素(STR)、阿奇霉素(AZI)、萘啶酸(NAL)、左氧氟沙星(LEV)、環丙沙星(CIP)、復方新諾明(SXT)、磺胺異惡唑(Sul)、氯霉素(CHL)、多粘菌素E(CT)、多粘菌素B(PB)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/C)和頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/C)。

1.4 統計學及生物信息學分析 采用SPSS 20.0對數據進行統計分析，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。用Bio Nu merics7.6軟件對PFGE圖譜進行分析處理。

2 結 果

2.1 流行特征

2.1.1 時間分布 2010－2018年馬鞍山市腹瀉患者中非傷寒沙門菌的感染率為8.8%(263/2 998)，其中2017年最高(16.0%，42/263)，年間感染率差異有統計學意義(χ2＝72.98，P＜0.001)。2014－2018年，除1月份外各月份均有非傷寒沙門菌檢出，6－8月份感染率較高，見圖1。

2.1.2 人群分布 2014－2018年腹瀉患者中非傷寒沙門菌的感染率為11.4%(215/1891)，男性感染率為10.3%(106/1 028)，女性為12.6%(109/863)，不同性別檢出率差異無統計學意義(χ2＝0.436，P＝0.509)。非傷寒沙門菌腹瀉病例最小年齡為1歲，最大為91歲，年齡中位數為26歲，以0～5歲年齡組感染率最高(15.9%，88/554)，年齡組間感染率差異有統計學意義(χ2＝20.813，P＝0.001)，見表1。

圖1 非傷寒沙門菌腹瀉病例的時間分布情況Fig.1 Time distribution of Non-typhoid Salmonella diarrhea cases

表1 2014－2018年不同特征腹瀉病例非傷寒沙門菌感染率的比較Tab.1 Comparison of Non-t yphoid Salmonella infection rates in different diarrhea cases from 2014 to 2018

2.2 血清型分布 263例非傷寒沙門菌病例中共分離出265株非傷寒沙門菌，共有36個血清型，主要為阿貢納沙門菌(25.4%)、腸炎沙門菌(20.4%)和鼠傷寒沙門菌(20.0%)。不同年份優勢血清型有所不同，2014年以腸炎沙門菌為主，2015年以鼠傷寒沙門菌為主，而2016和2017年以阿貢納沙門菌為主，見圖2。

圖2 2010－2018年非傷寒沙門菌的血清型分布Fig.2 Serotype distribution of Non-typhoid Salmonella from 2010 to 2018

2.3 PFGE分型 為了解本地區是否發生過沙門菌腹瀉的既往暴發并建立和完善沙門菌的分子分型數據庫，本研究對所分離的非傷寒沙門菌進行了PFGE分型。下面列出了阿貢納沙門菌的PFGE聚類圖，62株阿貢納沙門菌分為25種帶型，帶型相似度在54.7%～100%，帶型相同的有8組，最多的組有19株，帶型結果顯示阿貢納沙門菌有成簇出現的情況，見圖3，其他非傷寒沙門菌未出現菌株成簇現象。

圖3 阿貢納沙門菌PFGE聚類圖譜Fig.3 PFGE clustering patter n of Salmonella Agona

2.4 耐藥性分析

2.4.1 耐藥率 為了解本地區近年來2種優勢沙門菌的耐藥情況，本研究選取2015－2018年分離的39株腸炎沙門菌和30株鼠傷寒沙門菌，使用27種抗生素進行藥物敏感性試驗。結果顯示測試菌株對A MP的耐藥率最高為79.7%，對STR和Sul的耐藥率較高分別為75.3%和66.6%，而對AZI和AMI全部敏感，見表2。

表2 69株非傷寒沙門菌對27種抗生素的耐藥率(%)Tab.2 Resistance rate of 69 strains of Non-typhoid Salmonella to 27 antibiotics(%)

2.4.2 耐藥譜 測試菌株的總耐藥率為95.6%(66/69)，多重耐藥率為82.6%(57/69)，耐7種及以上藥物的菌株占30.4%(21/69)。耐藥模式為A MP-TET-Sul-MIN-DOX-STR的菌株最多，占8.7%(6/69)。菌株最多可耐16種藥，見表3。發現2株產ESBLs的菌株，1株為腸炎沙門菌，1株為鼠傷寒沙門菌，2株菌均為多重耐藥菌株。

2.4.3 腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌對各種抗生素敏感性的比較 腸炎沙門菌對四環素類藥物(如TET、MIN和DOX)敏感性較鼠傷寒沙門菌高，而鼠傷寒沙門菌對喹諾酮類藥物(NAL、CIP和LEV)敏感性較腸炎沙門菌高。此外，研究還發現，腸炎沙門菌對A MC、GEN和CHL的敏感性較高，而鼠傷寒沙門菌對CFZ和Sul的敏感性較高。以上差異均具有統計學意義(P＜0.01)，見表4。

表3 非傷寒沙門菌的耐藥譜分布Tab.3 Dr ug resistance spectr um distribution of Non-typhoid Salmonella

表3 (續)

3 討 論

近年來國內非傷寒沙門菌感染率有一定的地域性差異，本研究結果顯示2010－2018年馬鞍山地區腹瀉患者中非傷寒沙門菌的流行特征，非傷寒沙門菌腹瀉的平均感染率為8.8%，高于安徽合肥(2.9%)[8]，低于浙江余姚(12.9%)[9]。非傷寒沙門菌在0～5歲兒童組高發，這與我國多地區的研究結果一致[9-10]，可能與兒童免疫力低下有關。非傷寒沙門菌腹瀉具有一定的季節性，6－7月為高發時間，可能由于此段時間內環境溫度有利于非傷寒沙門菌的生長繁殖，導致沙門菌感染的幾率增加。因此，建議民眾應在感染高發季節注意飲食，監管部門應加強監管力度并做好防控措施。

感染性腹瀉是發展中國家的常見疾病，非傷寒沙門菌是感染性腹瀉的重要致病菌，其中腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌一直是國內外公認的2種優勢血清型[11]。而本地區的優勢血清型為阿貢納沙門菌，這與國內多地區[8-10，12]的結果均不一致，阿貢納沙門菌為優勢血清型是本地區的流行特點。

當今食品流通方式的多樣化使食源性疾病的發病模式亦發生改變，由暴發轉為多點散發。傳統的分型方法已經不能滿足食源性疾病在暴發中溯源的需求[13]，PFGE目前被廣泛地應用于疾病的溯源。建立并完善沙門菌的分子分型(PFGE)數據庫，對了解PFGE分型特點、流行病學分布、沙門菌的監測及暴發調查尤為重要[14]。阿貢納沙門菌的PFGE聚類分析顯示有菌株成簇現象，提示本地區可能出現過阿貢納沙門菌腹瀉的既往暴發或聚集性疫情。

由于抗生素和廣譜抗菌藥物的廣泛應用，使得病原菌類型變化及耐藥性增強成為感染領域中的首要問題[15]。有研究表明[16]2016年我國食源性沙門菌整體耐藥水平較高，多重耐藥嚴重，對 NAL、TET、A MP的耐受性較強，且耐藥情況與2015年保持一致[17]。本研究結果顯示，測試菌株對A MP、STR和Sul的耐藥率較高，總耐藥率和多重耐藥率均高于北京昌平地區[18]。氟喹諾酮類和三代頭孢類抗生素是臨床上治療沙門菌感染的一線用藥[19-21]，而本研究中的測試菌株對三代頭孢的敏感性大于90%，對喹諾酮類敏感性低于50%，提示臨床需合理用藥，避免抗生素濫用造成的耐藥菌株的產生。研究還發現腸炎沙門菌對四環素類藥物的敏感性較高，而鼠傷寒沙門菌對喹諾酮類藥物的敏感性較高，這種差異是否與不同沙門菌的基因組結構有一定的相關性，具體原因還有待于進一步研究。

本研究的腹瀉病例為監測人群非傷寒沙門菌感染數據，隨著病例監測力度的加強和范圍加大，以及醫療機構實驗室檢測能力提高，建立全覆蓋本地區且監測多種類病原的局域網絡實驗室將是疾病監測的發展趨勢，這樣會更有利于及早發現和控制腸道傳染性疾病。

表4 兩種優勢血清型沙門菌對藥物敏感性的比較Tab.4 Comparison of drug sensitivity between two dominant serotypes of Salmonella