苦參燥濕止癢洗劑質量標準研究

張樂青，亓淑芬*，李 培

（1. 陽谷縣人民醫院，山東 陽谷 252300；2. 聊城市食品藥品檢驗檢測中心，山東 聊城 252000）

苦參燥濕止癢洗劑是陽谷縣人民醫院根據臨床實踐總結的有效方劑，由苦參、黃柏、蛇床子、白鮮皮、荊芥、防風、透骨草、地膚子、花椒共九味中藥組成；有清熱燥濕、殺蟲止癢功效；用于治療帶下病屬濕熱下注證，癥見帶下量多、色黃、氣臭、外陰瘙癢等。為保證苦參燥濕止癢洗劑臨床療效和質量穩定，本研究制定了蛇床子、防風的薄層鑒別方法。苦參為該洗劑中的君藥，有殺蟲利尿，清熱燥濕功效，主要活性成分為苦參堿，采用HPLC測定其含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 InfinityⅡ色譜工作站（美國安捷倫公司）；檢測器（DEBAV00573）；KH3200DB型數控超聲波清洗器（昆山禾創）；ZW-3型多功能紫外分析儀（濟南三泉中石）；BSA224S-CW電子天平（北京賽多利斯）；硅膠板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥與試劑

苦參堿對照品（批號110805-201709），蛇床子素對照品（批號101236-201509），防風對照藥材（批號120947-201409），均由中國食品藥品檢定研究院提供。苦參燥濕止癢洗劑由陽谷縣人民醫院提供（批號：20190822，20190825，20190828）；蛇床子陰性溶液、防風陰性溶液、苦參陰性溶液均為處方除去相應藥味后，按處方比例及制備工藝同法制得；乙腈（瑞典歐普森）為色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 蛇床子素 取30 ml苦參燥濕止癢洗劑，先后兩次分別加30 ml乙醚萃取，合并萃取液，水浴蒸干，殘渣加1 ml乙醇使溶解，作為供試品溶液。取30 ml蛇床子陰性溶液，按照供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。另取蛇床子素對照品，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取上述3種溶液各8 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯（15:1）為展開劑，展開，取出薄層板，晾干，置紫外燈（365 nm波長）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液相應的位置上，出現相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，結果見圖1。

圖1 蛇床子薄層色譜鑒別

2.1.2 防風 取20 ml苦參燥濕止癢洗劑，使用二氯甲烷液萃取兩次，每次20 ml，棄去二氯甲烷液，水液用正丁醇提取2次，每次20 ml，合并兩次正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取20 ml防風陰性溶液，按上述方法制備陰性對照溶液。再稱取0.5 g防風對照藥材，加20 ml丙酮，超聲30 min，過濾，蒸干，殘渣加1 ml甲醇使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502），分別吸取上述3種溶液各5 μl，點在同一硅膠G薄層板上，用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（10:3:1）為展開劑，展開，取出薄層板，晾干，置紫外燈（254 nm波長）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液相應的位置上，出現相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。結果見圖2。

圖2 防風薄層色譜鑒別

2.2 苦參堿的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Ultimate XB-NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相[1-3]：無水乙醇-乙腈-3 %磷酸溶液（10:80:10），檢測波長：220 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 ml/min，進樣量：10 μl。理論塔板數按苦參堿峰計算應不低于2000。

圖3 高效液相色譜圖

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取苦參堿對照品12.66 mg，置入25 ml量瓶，加無水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為對照品貯備液。再精密量取對照品貯備液1 ml至10 ml量瓶，加無水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得[4]。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取苦參燥濕止癢洗劑20 ml，置分液漏斗中，加濃氨溶液1 ml混勻，加三氯甲烷萃取，共萃取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，殘渣加三氯甲烷適量使溶解，并轉移至25 ml量瓶，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液10 ml，加入中性氧化鋁柱（5 g，內徑1 cm），依次用20 ml三氯甲烷和20 ml三氯甲烷-甲醇（1:1）溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加無水乙醇適量使溶解，并轉移至10 ml量瓶，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 精密量取苦參陰性溶液20 ml，按2.2.3項下方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl，按2.2.1項下色譜條件進行測定并且記錄色譜圖，見圖3。供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖的相應位置，有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照溶液在此保留時間處無干擾。

2.2.6 線性關系考察 精密量取對照品貯備液0.2，0.5，1，2，4 ml，分別置入10 ml量瓶，加無水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述不同濃度的對照品溶液各10 μl，按2.2.1項下的色譜條件進樣測定。以峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，得線性回歸方程為Y=60.038C-97.8，r=0.9998（n=5）。結果表明，苦參堿在濃度為10.128～202.56 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.7 重復性試驗 取同一批（批號：20190822）樣品5份，按2.2.3項下的方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，測得苦參堿的平均含量為0.123 mg/ml，RSD為0.3 %（n=5），表明方法重復性良好。

2.2.8 穩定性試驗 取線性關系考察項下質量濃度為50.64 μg/ml的苦參堿對照品溶液，分別在配制后0，2，4，8，10，12 h進樣測定，結果苦參堿峰面積的RSD為0.9 %（n=6）。結果表明，對照品溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.9 精密度試驗 取2.2.6項下的對照品溶液（濃度為50.64 μg/ ml），連續進樣測定5次，結果苦參堿峰面積的RSD為0.4 %（n=5），結果表明儀器精密度良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 分別精密量取已知苦參堿含量的樣品溶液（批號：20190822）10，20，30 ml各2份，置于分液漏斗中，再分別加入濃氨溶液0.5，1，1.5 ml，混勻，用20 ml三氯甲烷萃取3次，合并萃取液，蒸干，殘渣加三氯甲烷適量使溶解，并轉移至25 ml量瓶，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取各溶液10 ml，加入中性氧化鋁柱（5 g，內徑1 cm），再精密量取苦參堿對照品貯備液1 ml共3份、2 ml共3份，分別加入中性氧化鋁柱（5 g，內徑1 cm）中，依次用20 ml三氯甲烷和20 ml三氯甲烷-甲醇（1:1）溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加無水乙醇適量使溶解，并轉移至10 ml量瓶，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。按2.2.1項下色譜條件進行測定，測得苦參堿的平均回收率為99.7 %，RSD為1.1 %（n=6），見表1。

表1 加樣回收率試驗（n=6）

2.2.11 樣品含量測定 取3種不同批號的樣品溶液（批號為20190822，20190825，20190828），按2.2.3項方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，按外標法計算各供試品中苦參堿的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

參考《中國藥典》及相關文獻，對苦參燥濕止癢洗劑中防風進行TLC鑒別，分別采用三氯甲烷-甲醇（3:1）[5]、氯仿-無水乙醇-乙酸乙酯（42:1）[6]、三氯甲烷-甲醇（4:1）[7]及二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇（10:3:1）做展開劑，結果以二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇（10:3:1）為展開劑時，各斑點間的分離度比較好，陰性溶液無干擾，且主斑點更加清晰。在對蛇床子進行TLC鑒別研究中，分別采用甲苯-乙酸乙酯（9:1）[8]、苯-乙酸乙酯（30:1）[9]、苯-乙酸乙酯（15:1）為展開劑，結果以苯-乙酸乙酯（15:1）為展開劑時，薄層板顯色后主斑點更清晰；且只有在該展開劑條件下，各斑點分離清晰。因苦參堿的含量可采用HPLC法進行較為精確的測定，故不再做苦參的薄層鑒別。

在苦參堿含量測定供試品的制備研究發現，實驗過程中取樣品40 ml制成供試品溶液，取10 μl注入液相色譜儀測定，消耗三氯甲烷和濃氨試液均較多，結果RSD大于2.0 %；取樣品10 ml制成供試品溶液，取10 μl注入液相測定，結果峰形不理想，最終確定取樣量為20 ml，得濃度為120 μg/ml的供試品溶液時，得到的色譜圖最理想。苦參中的活性成分主要為苦參堿和氧化苦參堿，氧化苦參堿在加熱提取的過程中逐漸被還原成苦參堿[10]，而苦參燥濕止癢洗劑是經過加熱提取的，氧化苦參堿未檢出，所以本實驗采用HPLC只檢測苦參中的苦參堿含量。本方法簡便、準確，重現性好，結果穩定，可為控制苦參燥濕止癢洗劑的質量，保證其臨床用藥的有效性提供參考。