HPLC同時測定附子理中丸（大蜜丸）中果糖和葡萄糖的含量

武紅娜，王曉琦，潘海霞

（滄州市食品藥品檢驗所，河北 滄州 061000）

附子理中丸是甲類非處方藥，出自宋代《惠民藥局方》，具有溫中健脾的功效，用于脾胃虛寒、脘腹冷痛、手足不溫等癥[1-4]，臨床應用廣泛。目前，附子理中丸有大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸和濃縮丸4種劑型，其中大蜜丸、小蜜丸和水蜜丸3種劑型均收載于《中國藥典》2015年版一部 ，由附子（制）、干姜、炒白術、黨參和甘草5味藥加煉蜜制成[1]。

煉蜜是由蜂蜜煉制而成，作為蜜丸中常用的輔料，據(jù)調(diào)查目前市場上不排除存在劣質(zhì)蜂蜜制丸的現(xiàn)象[5-6]。現(xiàn)行標準中未對輔料蜂蜜質(zhì)量進行控制，故擬建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定附子理中丸（大蜜丸）輔料蜂蜜中葡萄糖和果糖成分，以期為附子理中丸及同類藥品的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC20AT型 HPLC儀，RID-10A檢測器（日本島津公司）；LC350A型超聲波處理器（濟寧市魯超儀器有限公司）；CP225D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）； Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試劑與試藥

果糖對照品（批號：100231-201807），D-無水葡萄糖對照品（批號110833-201707，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純），醋酸（色譜純），磷酸（純度85 %，默克公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水（自制）。附子理中丸（大蜜丸）15批次，來自我省11個地市，產(chǎn)自全國各地不同企業(yè)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

流動相：乙腈-水（85:15），流速0.8 ml/min，以Prevail Carbohyrate ES為色譜柱，柱溫25 ℃，示差折光檢測器檢測。理進樣體積15 μl。理論板數(shù)：按果糖峰計應不低于2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照溶液的制備 取果糖、D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加40 %乙腈，分別制成每1 ml含果糖15 mg、D-無水葡萄糖16 mg的溶液，搖勻，濾過，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品剪碎，取約2.0 g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入40 %乙腈50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，用40 %乙腈補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按附子理中丸的處方比例和生產(chǎn)工藝制備缺煉蜜的陰性樣品，并按2.2.1項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 精密量取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜（見圖1）。由圖1可見，供試品溶液主峰與對照品溶液主峰保留時間一致，陰性對照溶液無干擾，說明本方法專屬性良好。

圖1 HPLC圖譜

2.3.2 線性關系考察 分別配制果糖、D-無水葡萄糖系列濃度混合對照品溶液，使其每1 ml分別含果糖5.0001，10.0002，15.0005，20.0073，25.0013 mg，D-無水葡萄糖5.3337，10.6669，16.0002，21.3341，26.6673 mg。精密吸取系列濃度混合對照品溶液各15 μl，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積（Y）對進樣量（X，μg）進行線性回歸。果糖回歸方程為：Y=3.07523X+0.18501，相關系數(shù)r=0.9998，結果顯示果糖在75.0015～375.0150 μg范圍內(nèi)線性關系良好。葡萄糖回歸方程為：Y=3.2692X+0.1175，相關系數(shù)r=1.0000，結果顯示葡萄糖在80.0015～400.0075 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取2.2.1項下同一對照品溶液15 μl，連續(xù)進樣6次，按2.1項下色譜條件測定，結果果糖、葡萄糖峰面積RSD分別為0.5 %，0.9 %，說明本方法精密度較高。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 按2.2.2項下方法制備附子理中丸（2號企業(yè)，批號為180101）的供試品溶液，進樣分析。于2，4，8，12，24 h后分別再次進樣分析，記錄并比較果糖、葡萄糖含量的變化，評價樣品溶液中果糖、葡萄糖室溫放置不同時間的穩(wěn)定情況。結果6個檢測點果糖、D-無水葡萄糖峰面積的RSD分別為0.3 %，0.1 %，表明果糖、葡萄糖在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批號樣品附子理中丸（2號企業(yè)，批號：180101）6份，按2.2項下方法制備對照品和供試品溶液，進樣分析，記錄并比較果糖、葡萄糖含量的變化。結果6份樣品的果糖、D-無水葡萄糖的RSD為分別為0.6 %，0.5 %（均小于2 %），表明該方法重復性良好。

2.3.6 回收率試驗 取已知含量的附子理中丸（2號企業(yè)，批號：180101）樣品約1.5 g，精密稱定，置50 ml具塞錐形瓶中，共9份，按樣品含量的50 %，100 %，150 %，分別加入3個不同濃度果糖、D-無水葡萄糖的混合對照品溶液（每個濃度 3 份），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算回收率。結果平均回收率分別為100.03 %，99.34 %，RSD分別為1.33 %，1.42 %，表明該方法回收率良好，結果見表1。

2.4 樣品測定

精密稱取15批次附子理中丸 （大蜜丸）樣品各2份，分別按2.2項方法制備對照品溶液和供試品溶液，分別按2.1項色譜條件測定果糖和葡萄糖的含量，以外標法計算樣品含量，結果見表2。附子理中丸果糖與葡萄糖總量在23.9 %～50.8 %之間，果糖與葡萄糖比值分別在0.65～2.11之間。

3 討論

蜂蜜是附子理中丸（大蜜丸）的主要輔料，具有潤腸降壓、保護肝臟、增強免疫力的效果[7]，主要成分有蛋白質(zhì)、糖類、維生素、多酚類和礦物質(zhì)等。作為一個復方藥物，附子理中丸成分復雜，因此本研究對提取方式和指標成分均進行了優(yōu)化選擇。

3.1 指標成分的選擇

2015年版《中國藥典》一部規(guī)定，蜂蜜中果糖和葡萄糖的總含量不得低于60 %，果糖與葡萄糖含量比值不得小于1.0[1]。因此，糖類成分為蜂蜜質(zhì)量考察的重要指標[8-9]。本研究根據(jù)上述標準及樣品測定結果，結合制劑工藝等因素，擬定附子理中丸（大蜜丸）果糖、葡萄糖總量（%）不得少于31.4 %，比值不得小于1.0 %，與藥典標準統(tǒng)一。

表1 加樣回收率測定結果（n=9）

表2 樣品測定結果

3.2 柱溫考察

分別設置柱溫20，25，30，35，40 ℃，測定供試品溶液，結果溫度在30 ℃以上色譜峰的保留時間有嚴重漂移，考慮到環(huán)境溫度等綜合因素，最終確定試驗溫度為25 ℃。

綜上所述，該方法科學、可靠，能在短時間內(nèi)同時檢測附子理中丸中果糖和葡萄糖含量，最大限度地排除其他化學成分的干擾，具有快速、靈敏和準確的優(yōu)點，為該藥輔料的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。