辣木葉高效高壓差低溫連續(xù)式提取工藝優(yōu)化及過程控制指紋圖譜研究

劉常青，段海霞，唐曉純，宋力飛，劉鄉(xiāng)鄉(xiāng)

（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510663）

辣木（Moringa oleiferaLam）是辣木科（Moringaceae）、辣木屬（Moringa Adans）植物，又名鼓槌樹，原產(chǎn)于熱帶、南亞熱帶的干旱或半干旱地區(qū)，目前在海南、福建、廣東等南方地區(qū)均有栽培[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，辣木葉的化學成分主要有黃酮類、多糖類、生物堿類和蛋白質等[3]，在降血糖[4-5]、降脂[6]、抗氧化[7]、改善睡眠[8]等方面有顯著效果。其中，黃酮類成分主要有異槲皮苷、沒食子酸、山奈酚、綠原酸等[3]，且含8種人體生命活動所需的必需氨基酸[9]。

高效高壓低溫連續(xù)式提?。╤igh performance high pressure and low temperature successive extraction，HHLSE）技術可在極短的時間內形成-0.1～35 Mpa高壓差并形成高速流，使細胞完全破碎，可促進有效成分的快速溶解，大大提高目標成分的提取率。本研究采用HHLSE技術[10]制備辣木葉提取物，通過正交試驗對HHLSE參數(shù)進行優(yōu)化，同時采用指紋圖譜對關鍵點的工藝過程進行質量評價，能更直接、更充分地監(jiān)測工藝過程中目標成分的轉移，為辣木葉相關產(chǎn)品的開發(fā)提供穩(wěn)定可靠的技術保證。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效高壓差連續(xù)式低溫提取分離濃縮集成技術裝備（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司）；800B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；Agilengt1100系列高效液相色譜儀（包括DAD 陣列檢測器，美國Agilent 公司）；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；DV215CD 型電子天平（美國奧豪斯公司）；KQ3200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW135 型中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；FJ-200高速分散均質機（上海標本模型廠）；ZL-I-021手持糖度計（廣州計量檢測技術研究院）；R系列旋轉蒸發(fā)儀（無錫星海生化設備有限公司）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）。

1.2 材料

辣木葉，產(chǎn)自云南西雙版納，2019年4月采摘；沒食子酸（成都普思生物科技有限公司，純度≥90.1 %，批號：P80380030）；異槲皮苷（北京儀化通標科技有限公司，純度≥98 %，批號：170526-0373）；乙腈，甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 原藥材前處理

取適量干燥的辣木葉藥材，經(jīng)萬能粉碎機粉碎后過80目篩，保存于陰涼室中，待用。

2.2 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.05 %磷酸（B），梯度洗脫：0～20 min，5 %～10 % A；20～40 min，10 %～28 % A；40～65 min，28 %～50 %A；65～75 min，50 %～100 %A；檢測波長為230 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μl；體積流量為1.0 ml/min。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 原藥材供試品溶液制備 精密稱取辣木葉粉末4 g，置于50 ml錐形瓶中，加入純化水20 ml，超聲處理30 min（功率500 W，頻率53 kHz），補足減失的重量，過濾，搖勻后取濾液，0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 工藝過程樣品處理 工藝過程中固體樣品按2.3.1項下方法處理，即得；液體樣品經(jīng)真空干燥，1:5純水復溶，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 沒食子酸和異槲皮苷對照品溶液制備

精密稱取沒食子酸對照品和異槲皮苷對照品各適量，分別用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，搖勻，即得質量濃度為0.2523 mg/ml的沒食子酸對照品溶液和0.2254 mg/ml的異槲皮苷對照品溶液。

2.5 指標性成分的指認

采用對照品對HPLC指紋圖譜中的各峰進行歸屬，結果見圖1。經(jīng)過對辣木葉細碎品和對照品色譜圖相對保留時間和紫外吸收光譜兩項指標的比對，確定了異槲皮苷、沒食子酸為辣木葉中的主要黃酮類活性成分，且含量較高，故將兩者作為指標性成分。HPLC指紋圖譜中，沒食子酸的洗脫時間為8.653 min，異槲皮苷的洗脫時間為56.2 min。

2.6 不同提取工藝的對比研究

圖1 辣木葉與對照品HPLC指紋圖譜匹配圖

2.6.1 熱回流提取 參考相關文獻[11]，準確稱取適量辣木葉粉末，置入500 ml圓底燒瓶，加入200 ml純化水，加熱回流2 h后，冷卻至室溫，收集提取液，4000 r/min離心分離，將所得上清和沉淀物分別按2.3.2項下方法制備供試品溶液后，進行HPLC指紋圖譜分析。

2.6.2 HHLSE 準確稱取適量辣木葉細碎品，按一定的溶劑倍量加入適量純化水，于常溫下進行高效高壓提取，提取液經(jīng)4000 r/min分離，將所得上清和沉淀物分別按2.3.2項下方法制備供試品溶液后，進行HPLC指紋圖譜分析。兩種提取方式所得樣品的HPLC指紋圖譜見圖2。

圖2 2種提取工藝的HPLC指紋圖譜對比

由圖2可見，兩種提取方式所得離心上清譜圖信息差異較大：熱回流所得離心上清譜圖中的成分種類遠少于HHLSE，兩種指標性成分均被破壞；HHLSE所得離心上清譜圖中的成分種類與辣木葉原料基本一致，且沒食子酸和異槲皮苷兩種成分能得到很大程度的保留。同時對比兩種不同工藝的離心沉淀色譜圖，兩者峰型相似，成分種類及含量均遠少于相對應的離心上清，說明僅有極少部分水溶性成分未被提取出，因此后續(xù)試驗可直接舍棄離心沉淀。

2.7 辣木葉HHLSE提取工藝優(yōu)化

2.7.1 辣木葉蛋白質提取率測定 參考相關文獻[12]，采用凱氏定氮法測定辣木葉中蛋白質含量：準確稱取2 g供試辣木葉粉，平行測定3份，計算平均值，同時吸取空白消化液作為空白。按不同條件提取辣木葉蛋白質后，4000 r/min離心15 min，上清采用凱氏定氮法測定蛋白質含量，按下式計算蛋白質提取率。

提取率（%）=提取液中蛋白含量/辣木葉干粉中粗蛋白含量×100

2.7.2 正交試驗設計 本研究采用小型均質機模擬高壓差提取器提取過程，簡便有效地優(yōu)化辣木葉提取條件，為后續(xù)HHLSE提供依據(jù)。選定提取溶劑類型、提取次數(shù)及溶劑倍量[即固液比（g/g），每克藥材使用的提取溶劑總量]作為考察的3個因素，以蛋白質提取率為評價指標，采用L9（33）正交試驗進行研究。詳見表1、表2。

表1 正交試驗設計

表2 正交試驗結果

由表2可見，溶劑類型對辣木葉蛋白質的提取率影響最大，提取次數(shù)、溶劑倍量的影響無統(tǒng)計學意義。經(jīng)直觀比較并結合試驗結果，辣木葉蛋白均質提取最優(yōu)條件為：以純化水為溶劑，溶劑倍量30，提取3次，蛋白質平均提取率27.9 %。

2.8 驗證試驗

根據(jù)生產(chǎn)實際并結合L9（33）正交試驗結果，取藥材量30倍的水，在-0.1～35 Mpa壓差下HHLSE提取3批，蛋白質平均提取率為48.56 %，RSD為1.54 %，表明此工藝穩(wěn)定可行。

2.9 辣木葉HHLSE提取濃縮過程指紋圖譜分析

以沒食子酸和異槲皮苷為指標性成分，采用HPLC指紋圖譜對工藝關鍵點進行評價。按前期確定的工藝參數(shù)，選定辣木葉原材、離心、微濾、反滲透濃縮、噴霧干燥等關鍵工序，收集各工序樣品，分別按2.3項下方法制備供試品溶液，進行HPLC指紋圖譜分析比對，見圖3、圖4。

圖3 辣木葉原材與提取樣品HPLC指紋圖譜對比

圖4 辣木葉4個HHLSE工藝關鍵點樣品HPLC指紋圖譜對比

由圖3與圖4可見，藥材中沒食子酸和異槲皮苷這兩種成分能高效轉移至最終的噴霧干燥粉中，而離心沉淀、微濾濃液及反滲透濃縮清液中兩種指標性成分含量極低，且譜圖信息少，工藝過程可直接舍棄這3部分物料，也充分說明HHLSE組合提取工藝能保留辣木葉大部分有效成分，為辣木相關產(chǎn)品的開發(fā)提供可靠的提取工藝。

3 討論

本研究結果表明HHLSE提取效果優(yōu)于熱回流提取；另結合均質提取正交試驗法優(yōu)化HHLSE提取工藝條件，最終確定HHLSE方式最佳工藝條件為：提取溶劑水，溶劑倍數(shù)為30倍，蛋白質提取率可達48.56 %；分析HHLSE提取、過濾濃縮過程中關鍵控制點的指紋圖譜，表明HHLSE組合提取工藝適用于辣木葉有效成分的提取及保留，可為辣木相關產(chǎn)品的開發(fā)提供可靠的提取工藝。