電針對顱腦損傷后認知障礙大鼠海馬磷酸化認知缺陷突觸相關蛋白的調節作用※

郭新榮 李婉露 劉 寧 馬小衛

(陜西中醫藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046)

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)臨床常表現為意識喪失、失語、頭痛、眩暈及認知障礙(cognitive dysfunction，CD)等[1-2]，CD是多數TBI患者伴有的最持久、最嚴重的癥狀之一，特別是學習新知識能力減退，給個人、家庭和社會帶來沉重負擔[3]。臨床實踐表明電針治療TBI后CD療效肯定[4-5]。為進一步探討其作用機制，本實驗研究電針對TBI后CD大鼠海馬磷酸化認知缺陷突觸相關蛋白(SynGAP)的調控作用，以期為電針治療TBI后CD的臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雄性大鼠80只，體質量220～240 g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(陜)2012-003號。飼養環境：溫度18～24 ℃,濕度60%～70%，自由飲水，自然光照。

1.1.2 主要試劑 4%多聚甲醛溶液、含戊二醛的4%多聚甲醛溶液(美國Sigma公司)；2.5%戊二醛溶液(湖北新景新材料有限公司)；兔抗SynGAP一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；即用型鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化染色試劑盒(兔源二抗)(武漢博士德生物工程有限公司)；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；2%戊巴比妥鈉溶液[默克化工技術(上海)有限公司]；硫酸慶大霉素注射液(國藥集團容生制藥有限公司，國藥準字H41024153)；注射用氨芐西林鈉[石藥集團中諾藥業(石家莊)有限公司，國藥準字H13021267]。

1.1.3 主要儀器 腦立體定位儀(ST-3ND型，成都儀器廠)；電子顱腦損傷儀(eCCI-6.3型，美國VCU大學)；自動酶標儀(Spectra M5型，美國Molecular Devices公司)；MORRIS水迷宮視頻分析系統(RD1101-MWM-G型，上海移數信息科技有限公司)；超聲波細胞粉碎儀(JY92-Ⅱ型，寧波新藝超聲設備有限公司)；微型臺式高速冷凍離心機(5417R型，德國Eppendorf公司)；脫色搖床(TY-80S型，南京新校園生物技術研究所)；基礎型電源(美國Bio-Rad公司)；電泳槽(美國Bio-Rad公司)；轉印槽(美國Bio-Rad公司)；正置研究級顯微鏡(日本Nikon)；日立透射電子顯微鏡(H-7650型，日本日立)；電針儀(G6805-1A型，上海華誼醫用儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物選擇及分組 將80只SD大鼠適應性喂養3 d后開始用水迷宮實驗篩選動物。每日上午1次，第4次水迷宮實驗結束后，將>90 s始終不能找到平臺的大鼠或<3 s能迅速找到平臺的大鼠剔除，共剔除16只。余64只納入研究，按照隨機數字表法分為2組，即空白組10只、造模組54只。

1.2.2 模型制備[6]除空白組10只大鼠外，造模組54只大鼠均進行TBI模型制備。大鼠術前禁食禁水8 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，頭頂正中消毒，切開皮膚，剝離骨膜，暴露右頂骨，定位標記冠狀縫后3 mm、中線右側旁開2.5 mm，用微型磨鉆鉆半徑為2 mm的骨窗，大鼠移至電子顱腦損傷儀上，設置參數為速度4 m/s、深度3 mm，打擊；打擊后如有出血，壓迫止血，傷口處滴硫酸慶大霉素注射液4～5 滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，縫合后用紅霉素軟膏涂抹縫合處及周圍。將大鼠放在棉墊上，保持呼吸暢通，注意保暖，待大鼠蘇醒后單籠飼養。術后予注射用氨芐西林鈉125 mg肌肉注射抗感染，每日1次，連用3 d。造模組在TBI造模過程中死亡4只，余50只又按造模前4次水迷宮實驗的逃避潛伏期成績，從用時由多到少依次篩選出34只，隨機分為模型組、電針組，各17只。對大鼠的處置嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》[7]。

1.2.3 治療方法 電針組大鼠予電針治療。動物固定于自制鼠板上，取百會、人中、左側內關、左側后三里、左側絕骨，定位參照《實驗針灸學》[8]，百會：頂骨正中；人中：唇裂鼻尖下1 mm正中；內關：前肢內側，離腕關節約3 mm的尺橈骨縫間；后三里：膝關節后外側，在腓骨小頭下約5 mm；絕骨：大鼠外踝上3 mm處。針刺操作：穴位消毒，選28號0.5寸華佗牌毫針，向前斜刺百會，直刺人中，直刺左側內關、左側后三里、左側絕骨，刺入深度為(5.0±0.2) mm，各穴行捻轉手法，得氣后留針。后三里接電針儀負極，絕骨接電針儀正極，選2 Hz、1 mA、連續波，每次20 min，每日1次，5次為1個療程，療程間休息2 d，共治療2個療程。空白組、模型組大鼠，每日抓拿1次，同樣方法固定20 min，常規消毒相應治療穴位，療程同電針組。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 水迷宮實驗 自電針組大鼠進行電針治療之日，各組隨機取8只大鼠進行水迷宮實驗。

1.3.1.1 定位航行實驗 大鼠依次從4個象限進入水中，90 s內爬上平臺的則記錄所用時間，即為逃避潛伏期；90 s內未找到平臺的則逃避潛伏期記錄為90 s。各組試驗期間，每日上午水迷宮實驗測試1次，連續進行12次。

1.3.1.2 空間探索實驗 最后一次定位航行實驗結束后，撤除平臺，將大鼠放入水中觀察，記錄大鼠90 s內經過原平臺所在區域次數。

1.3.2 光鏡觀察海馬CA1、CA3、DG區腦組織大體形態結構 治療結束后，各組隨機取2只大鼠，予0.9%氯化鈉注射液200 mL、4%多聚甲醛溶液200 mL心臟灌注，斷頭取腦組織，辨認海馬CA1、CA3、DG區。蘇木素—伊紅(HE)染色，光鏡下觀察大鼠海馬CA1、CA3、DG區腦組織大體形態結構。

1.3.3 電鏡觀察海馬CA1、CA3區腦組織超微結構 各組從余下大鼠中再隨機取2只大鼠，予含戊二醛的4%多聚甲醛溶液300 mL進行心臟灌注固定。斷頭取腦組織，在蠟板上用手術刀片橫斷面切開腦組織，辨認海馬CA1、CA3區，切下目標部位約2 mm×2 mm，放入2.5%戊二醛溶液中固定。送西安交通大學醫學部電鏡室，經清洗、脫水、浸透、包埋、切片、染色等步驟制成厚度50～70 nm的透射電鏡切片，電鏡下觀察海馬CA1、CA3區腦組織超微結構。

1.3.4 免疫印跡(Western Blot)檢測海馬區腦組織SynGAP含量 各組從余下大鼠中再隨機取6只大鼠，心臟灌注后斷頭取腦組織，分離出海馬區，稱質量記錄，并分成3份(每份>50 mg)，分別放入3個無菌離心管中，過液氮后放入超低溫冰箱凍存。蛋白樣品用高效RIPA法制備，BCA法測定蛋白濃度。上樣蛋白的制備；制12%的分離膠、5%的濃縮膠，灌膠；上樣；60 V低電壓電泳30 min，90 V電泳90 min；轉膜(400 mA，2.0 h)；洗膜(TBST洗5 min，2次；TBS洗10 min)；5%脫脂乳封閉，脫色；孵一抗(濃度1∶500～5 000)，4 ℃冰箱過夜；洗膜；孵二抗(濃度1∶5 000)過夜；洗膜；ECL發光(5～45 s)。圖像采集處理，設β-actin為內參，用Image Pro Plus 6.0軟件分別計算SynGAP和β-actin條帶的灰度和面積之乘積，再分別計算出SynGAP與β-actin的比值，獲得SynGAP相對含量。

2 結 果

2.1 水迷宮實驗

2.1.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 見表1。

由表1可見，第1～12次水迷宮實驗，模型組、電針組大鼠逃避潛伏期均較空白組延長(P<0.05)；與模型組比較，第1次水迷宮實驗，電針組逃避潛伏期較模型組延長，第2～7次較模型組縮短，但比較差異均無統計學意義(P>0.05)；第8～12次水迷宮實驗，電針組大鼠逃避潛伏期均較模型組縮短(P<0.05)。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

2.1.2 各組大鼠90 s內經過原平臺所在區域次數比較 見表2。

表2 各組大鼠90 s內經過原平臺所在區域次數比較 次，

由表2可見，模型組大鼠90 s內經過原平臺所在區域次數少于空白組(P<0.05)；電針組大鼠90 s內經過原平臺所在區域次數多于模型組(P<0.05)；電針組與空白組大鼠90 s內經過原平臺所在區域次數比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠光鏡下海馬區腦組織大體形態結構 空白組大鼠海馬區錐體細胞排列整齊，細胞間隙適當，細胞結構完整。模型組大鼠海馬區錐體細胞層變薄、稀疏、排列紊亂，細胞間隙增大，細胞結構不完整，甚至有大量細胞缺失。與模型組相比，電針組大鼠海馬區錐體細胞層增厚，神經元的萎縮、核固明顯縮少。見封2，圖1。

2.3 各組大鼠電鏡下海馬區腦組織超微結構 空白組大鼠海馬CA1、CA3區神經元細胞核飽滿，染色質均勻，胞核膜皺縮不明顯；突觸數量多，前膜內囊泡多，前后膜邊界清楚，后膜致密物質厚，活性區長度長。模型組大鼠海馬CA1、CA3區神經元細胞核有固縮，染色質不均勻；胞核膜明顯皺縮；線粒體有腫脹、空泡；突觸數量減少，前后膜邊界不清、甚或融合，前膜內嚢泡減少、突觸后膜致密物質稀疏，活性區長度較短。電針組海馬CA1、CA3區神經元細胞核較為飽滿，染色質均勻，胞核膜皺縮不明顯；突觸數量較多，前膜內囊泡較多，前后膜邊界清楚，后膜致密物質較厚，活性區長度較長。見圖2。

2.4 各組大鼠海馬區腦組織SynGAP相對含量比較 見表3。

表3 各組大鼠海馬區腦組織SynGAP相對含量比較

由表3可見，模型組大鼠海馬區腦組織SynGAP相對含量低于空白組(P<0.05)；電針組大鼠海馬區腦組織SynGAP相對含量高于模型組(P<0.05)；電針組與空白組大鼠海馬區腦組織SynGAP相對含量比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組大鼠海馬區腦組織SynGAP相對含量表達條帶圖見圖3。

圖3 各組大鼠海馬區腦組織SynGAP相對含量表達條帶圖

2.5 各組大鼠海馬CA1、CA3、DG區SynGAP的IOD比較 見表4。

表4 各組大鼠海馬CA1、CA3、DG區SynGAP的IOD比較

由表4可見，模型組大鼠海馬CA1、CA3、DG區SynGAP的IOD均低于空白組(P<0.05)；電針組大鼠海馬CA3、DG區SynGAP的IOD均高于模型組(P<0.05)，CA1區則無統計學意義(P>0.05)；電針組與空白組大鼠海馬CA1、CA3、DG區SynGAP的IOD比較差異均無統計學意義(P>0.05)。各組大鼠海馬CA1、CA3、DG區SynGAP表達見封2，圖4。

圖2 各組大鼠電鏡下海馬CA1、CA3區腦組織超微結構(×40 000)

3 討 論

針刺治療TBI后CD大鼠選用百會、人中、內關、后三里、絕骨穴，能醒腦開竅，調暢氣機，疏通經絡，有利于促進大鼠損傷腦組織的恢復[9-10]。本實驗所選TBI動物模型制備方法穩定、可靠[11-12]。本研究深入研究TBI后CD的發生，故增加了水迷宮實驗篩選[13]，結果證實模型組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期延長，空間探索實驗也表現較差。水迷宮實驗是目前用于檢驗大鼠認知障礙特別是學習功能障礙的經典實驗，本研究選擇公認的逃避潛伏期、經過原平臺所在區域次數作為觀察指標[14-15]，結果發現，隨著實驗時間延長，各組大鼠逃避潛伏期時間均縮短，可能因為大鼠隨著水迷宮實驗次數增多、重復而表現能力越來越好[16-17]，或者水迷宮實驗本身也是一種治療方法，有利于大鼠認知功能恢復。本研究結果發現，電針對TBI后CD大鼠確實起到治療作用，且隨著治療時間延長，效果更明顯。

本研究觀察發現，電針對TBI后CD大鼠海馬光鏡下大體形態和電鏡下超微結構均具有一定改善作用。SynGAP在哺乳動物腦內突觸后致密部高表達，有多個結構域，是多個信號通路中的關鍵蛋白之一。SynGAP上游受到N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)、鈣調蛋白依賴蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)、細胞周期素依賴蛋白激酶5(CDK5)的調控，下游又調控小G蛋白等，同時也負調控α-氨基-3-羥基-4異惡唑-丙酸(AMPA)受體向興奮性突觸后面運輸，參與各種病理生理機制，在改善智力低下、突觸可塑性中發揮重要作用[18-19]。相關研究表明，SynGAP在海馬區高度表達，并在神經可塑性變化及記憶形成中具有重要作用[20-21]。SynGAP通常是夾在支撐樹突棘形成其結構的支架上，組織了大鼠肉瘤(Ras)蛋白化學信號鏈反應的啟動，而后者是學習所需的信號通路。當鈣離子(Ca2+)涌入突觸后激活了CAMKⅡ，反過來將SynGAP從細胞支架處釋放出來，進一步刺激Ras信號通路開始傳遞信號。SynGAP還通過與突觸后致密蛋白95(PSD-95)、NMDAR受體結合，形成復合物，進一步調節細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信號通路，ERK/MAPK信號通路參與調節學習記憶過程[22]。本研究中，應用Western Blot檢測海馬區腦組織SynGAP，發現電針組大鼠SynGAP相對含量較模型組明顯上調。進一步免疫組化檢測發現電針組能夠上調CA3、DG區SynGAP的IOD，對CA1區上調不明顯。

綜上所述，電針治療TBI后CD的機制可能是促進了神經元突觸可塑性調節，進而調節了海馬CA3、DG區SynGAP含量。本實驗研究存在不足的地方：在電鏡檢測海馬區腦組織超微結構時，只觀察了海馬CA1、CA3區，未觀察海馬DG區，下一步研究應更全面觀察海馬各個分區的超微結構；只研究了治療結束時SynGAP表達變化，進一步可研究隨治療次數的SynGAP的動態變化。