雷公藤甲素配伍芍藥苷對L-02 細胞毒性的影響*

肖芳

（南昌大學第四附屬醫院 江西南昌330003）

雷公藤甲素（Triptolide,TP）是雷公藤的主要成分之一，具有顯著的免疫抑制和抗炎鎮痛作用，但它的毒性很強，急性中毒主要表現為肝損傷和胃腸道毒性，長期毒性表現為抑制骨髓，損害心臟、腎臟等器官[1～2]。白芍，苦、酸，微寒。歸肝、脾經，具有斂陰柔肝、緩急止痛的作用?，F代研究表明，白芍具有護肝和調節免疫的作用，《中華本草》中記載白芍具有抗炎和調節免疫的作用。有研究表明，白芍可對抗雷公藤多苷造成的小鼠急性肝損傷，降低血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）及丙二醛（MDA）含量，提高機體抗氧化能力[3～4]。本研究以正常人肝細胞L-02 細胞為模型研究TP 配伍芍藥苷對L-02 細胞毒性的影響。現報道如下：

1 材料

SW-CJ-2F 雙人雙面超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），L-02 細胞（購于中科院上海細胞庫），噻唑蘭（MTT，北京索來寶有限公司），酶標儀（Thermo公司），96 孔細胞培養板（賽默飛世尓生物化學制品有限公司），雷公藤甲素對照品（成都普菲德生物科技有限公司，批號：20150813，純度≥98%）；芍藥苷對照品（成都普菲德生物科技有限公司，批號：16011402，純度純度≥90%）。

2 方法

2.1 細胞培養 將L-02 細胞置于常規培養皿內，以高糖DMEM 培養基（含10%胎牛血清）在37℃、5%二氧化碳（CO2）和相對濕度90%的培養箱內培養，取對數生長期L-02 細胞，棄去原有培養液，用胰蛋白酶消化，將細胞均勻種于96 孔板上，所用細胞密度為 5×104個 /ml，每孔 200 μl，每個濃度設置 6個復孔，分別設空白，陰性和8 個濃度，96 孔板最外圈加 200 μl 無鈣鎂的 D-Hanks 緩沖液（HBSS）進行液封。細胞種板完后放于細胞孵育箱中培養24 h。

2.2 藥物溶液的配制

2.2.1 TP 溶液的配制 先用二甲基亞砜（DMSO）將TP 粉末溶解，再用培養液配制成20 μg/ml 的TP溶液（容量瓶要先加一部分水浴加熱好的培養液，且稀釋的整個過程中容量瓶均要放于水浴鍋中預熱，防止藥物析出）。以20 μg/ml 的TP 母液逐級稀釋成以下濃度：200.000 0 ng/ml，100.000 0 ng/ml，50.000 0 ng/ml，25.000 0 ng/ml，12.500 0 ng/ml，6.250 0 ng/ml，3.125 0 ng/ml，1.562 5 ng/ml。

2.2.2 芍藥苷溶液的配制 精密稱取10 mg 芍藥苷置于10 ml 容量瓶中，加入培養液適量，超聲2 min 使溶解，并定容至刻度，配成1 mg/ml 的母液。母液逐級稀釋成以下濃度：1 000.0 μg/ml，500.0 μg/ml，250.0 μg/ml，100.0 μg/ml，50.0 μg/ml，25.0 μg/ml，12.5 μg/ml。

2.2.3 TP、 芍藥苷配伍溶液的配制 將TP 與芍藥苷分別以 1:100，1:500，1:1 000，1:2 000 的比例配成以下濃度的溶液：200.000 0 ng/ml，100.000 0 ng/ml，50.000 0 ng/ml，25.000 0 ng/ml，12.500 0 ng/ml，6.250 0 ng/ml，3.125 0 ng/ml，1.562 5 ng/ml。

2.3 MTT 法測定L-02 細胞毒性 將培養24 h 的細胞取出，吸去培養液，用HBSS 液清洗2 遍后，分別加入上述配制不同濃度的藥物溶液，每個濃度設6 個復孔，空白和陰性組加入空白培養液，加入置于培養箱中繼續培養24 h；取出，吸去藥物溶液，用HBSS 液清洗 1 遍后，每個孔加入 20 μl 的 MTT 溶液，置于培養箱中繼續培養4 h；取出，吸去MTT 溶液，加入200 μl DMSO 溶液，在微型振蕩器上振蕩10 min。設置酶標儀的吸收波長為490 nm 測定各樣品吸光度。細胞存活率=（OD 試驗組－OD 陰性組）/（OD 陰性組－OD 空白組）×100%，其中OD 值為各組的吸光度值。

3 結果

3.1 TP 對L-02 細胞毒性的影響 TP 在12.500 0～200.000 0 ng/ml 的濃度范圍內細胞存活率均＜90%，且隨濃度的增加，其細胞存活率越小，說明TP在12.500 0～200.000 0 ng/ml 的濃度范圍內對L-02細胞存在毒性。見表1。

表 1 TP 對 L-02 細胞毒性的影響（n=6，）

表 1 TP 對 L-02 細胞毒性的影響（n=6，）

組別 OD 值 細胞存活率（%）空白陰性200.000 0 ng/ml TP 溶液100.000 0 ng/ml TP 溶液50.000 0 ng/ml TP 溶液25.000 0 ng/ml TP 溶液12.500 0 ng/ml TP 溶液6.250 0 ng/ml TP 溶液3.125 0 ng/ml TP 溶液1.562 5 ng/ml TP 溶液0.069±0.008 0.470±0.019 0.339±0.030 0.379±0.030 0.367±0.044 0.326±0.021 0.334±0.022 0.470±0.037 0.511±0.044 0.467±0.038-100.000 67.371 77.222 74.221 64.004 66.082 99.958 98.181 99.127

3.2 芍藥苷對L-02 細胞毒性的影響 芍藥苷在12.5～1 000.0 μg/ml 的濃度范圍內，L-02 細胞的存活率均＞90%，表明芍藥苷在此濃度范圍內對L-02 肝細胞不產生毒性。見表2。

表2 芍藥苷對L-02 細胞毒性的影響（n=6，）

表2 芍藥苷對L-02 細胞毒性的影響（n=6，）

組別 OD 值 細胞存活率（%）空白陰性1 000.0 μg/ml 芍藥苷溶液500.0 μg/ml 芍藥苷溶液250.0 μg/ml 芍藥苷溶液100.0 μg/ml 芍藥苷溶液50.0 μg/ml 芍藥苷溶液25.0 μg/ml 芍藥苷溶液12.5 μg/ml 芍藥苷溶液0.066±0.006 1.206±0.122 1.260±0.074 1.270±0.089 1.355±0.165 1.278±0.110 1.359±0.099 1.456±0.152 1.286±0.056-100.000 99.461 100.631 107.654 101.081 107.481 100.385 99.494

3.3 TP 配伍芍藥苷溶液對L-02 細胞毒性的影響當TP 與芍藥苷1:100 和1:500 的比例配伍時，對細胞的存活率均無影響，當TP 與芍藥苷以1:1 000 的比例配伍后可明顯增加L-02 細胞的存活率，且均＞90%，說明雷公藤甲素與芍藥苷以1:1 000 的比例配伍能降低雷公甲素對L-02 細胞的毒性作用。見表3。

表3 TP 配伍芍藥苷溶液對L-02 細胞毒性的影響（n=6）

4 討論

本實驗采用MTT 法研究了TP，芍藥苷，TP 與芍藥苷不同比例配伍溶液對L-02 細胞毒性的影響，實驗結果發現，TP 對L-02 細胞的無毒范圍在6.250 0 ng/ml 以下，芍藥苷的L-02 細胞無毒范圍在1 000.0 μg/ml 以下，當TP 與芍藥苷以1:1 000 的比例配伍時，TP 對L-02 細胞的無毒范圍在200.000 0 ng/ml以下，當TP 與芍藥苷以1:2 000 的比例配伍時，TP對L-02 細胞的無毒范圍在12.500 0 ng/ml 以下。說明TP 與芍藥苷以1:1000 的比例配伍時，可降低TP對L-02 細胞的毒性作用，明顯減輕TP 對L-02 細胞的損傷，提高細胞存活率。該結果為臨床上減毒增效，合理應用雷公藤提供了參考。

以往研究表明，TP 誘導L-02 凋亡是通過降低細胞中超氧化物歧化酶，破壞細胞內的抗氧化防御體系，使得細胞中的活性氧（ROS）相應地增多，從而增加細胞損傷作用[5]。芍藥苷降低TP 對L-02 細胞的毒性作用是否跟其能抑制細胞氧化有關及其具體作用機理都有待后期研究探索。