一個罕見黏多糖貯積癥Ⅲ型家系的診斷及產前診斷

潘麗，蘇文，林道彬

珠海市婦幼保健院產前診斷中心1、檢驗科/遺傳所2，廣東 珠海 519000

黏多糖貯積癥Ⅲ型(mucopolysaccharidosisⅢ，MPSⅢ)又稱Sanfilippo綜合征，屬于常染色體隱性遺傳病，是由于硫酸乙酰肝素降解過程中所需的四種不同酶的缺陷所致[1-2]，屬于一組溶酶體貯積癥。據缺陷酶類型的不同，可以把MPSⅢ分為ⅢA、ⅢB、ⅢC和ⅢD四種亞型。ⅢA型是由于乙酰肝素N-硫酸酯酶(heparan N-sulfatase，SGSH)缺陷，使硫酸乙酰肝素不能降解而在細胞內積聚，從而導致進行性多系統損害。4種亞型的患者臨床表現非常相似，主要為進行性的智力減退。該病臨床罕見，在國外新生兒中的發病率為1/70 000，而國內1998年至今報道黏多糖貯積癥Ⅲ型產前診斷的文獻僅一篇[3]。基因診斷和產前診斷，是目前預防并阻斷該病遺傳的有效方法。近年來，全外顯子測序(whole exome sequencing，WES)技術因為具有高通量、高準確性，還具有高速度等特點，已經被越來越多的臨床醫生接受，并且應用于臨床診斷[4]。本研究應用全外顯子測序技術對一個罕見MPSⅢ型家系進行突變分析，明確了家系的致病原因，并為該家系進行了詳細的遺傳咨詢及產前診斷，現報道如下：

1資料與方法

1.1 一般資料 孕婦，女，38歲，瑤族，因“停經16+周，不良生育史，高齡”于2019年7月就診于珠海市婦幼保健院產前診斷中心。既往體健，G4P2A1，2007年足月順產一女，體健。2013年足月順產一男(該患兒為先證者)，現年6歲，出生時無特殊，2歲以后出現進行性加重的智力低下，聽力下降，語言發育落后，只能發單音，頭部狹長。夫妻雙方臨床表型正常，否認近親結婚，否認家族遺傳病史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 孕婦及家屬知情同意，抽取患兒及其父母的外周靜脈血各5 mL，EDTA抗凝，用基因組提取試劑盒(美國Omega公司)提取外周血DNA，-20℃保存。胎兒羊水標本10 mL，基因組提取試劑盒提取羊水DNA，-20℃保存。

1.2.2 羊膜腔穿刺術 孕婦及家屬知情同意，孕19周選擇羊膜腔穿刺術。術前再次行B超檢查，明確胎兒雙頂徑、羊水池深度等情況。采用日本進口22G150 mm PTC穿刺針，B超引導下進針，抽取羊水10 mL送細胞培養染色體核型分析、染色體微陣列分析及全外顯子測序。

1.2.3 染色體核型分析 外周血或羊水細胞體外培養，經過收獲、制片、消化、G顯帶染色以及掃描后，行染色體核型分析。

1.2.4 染色體微陣列分析 使用美國Affymetrix公司的全基因組CytoScan 750K芯片，嚴格按照實驗操作流程，進行基因組DNA的消化、連接、PCR擴增、純化、芯片雜交、洗滌、掃描，最后進行數據分析。數據分析過程參考實驗室內部數據庫及在線公共數據庫。

1.2.5 全外顯子測序 送深圳華大臨床檢驗中心，進行全外顯子測序。首先利用Covaris LE220超聲波儀(Massachusetts，USA)將基因組DNA打斷并制備文庫，然后通過芯片對目標基因外顯子及臨近剪切區的DNA進行捕獲和富集，最后使用高通量測序平臺BGISEQ-500進行變異檢測，并依據ACMG指南判斷變異的致病性[5-8]。參考dbscSNV(1.1)數據庫、EPS6500(V2)數據庫、ExAC(r0.3.1)數據庫及千人基因組數據庫對數據進行信息學分析，參考基因突變相關數據庫GnomAD(r2.0.1)和Clinvar進一步對可疑致病位點進行確認，找出致病位點。

1.2.6 Sanger測序驗證 根據全外顯子測序的結果，采用Sanger測序對先證者及其父母進行驗證，明確致病位點，并對胎兒進行產前診斷。

1.2.7 遺傳咨詢 由經過專業培訓的臨床遺傳咨詢醫師進行所有項目的檢測前、檢測后以及患兒預后、治療的詳細遺傳咨詢及臨床評估。

2結果

2.1 患兒及其父母全外顯子測序結果 患兒全外顯子測序，目標區域平均測序深度為144.03倍，目標區域覆蓋度達99.89%，其中測序深度達到20倍以上的區域占全部芯片目標捕獲區域的98.00%，芯片對目標區域覆蓋良好。通過對測序數據進行過濾，篩選出了多個突變位點，詳見表l。通過數據分析，發現了SGSH基因的NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)突變已有致病性相關報道[9-10]，且ESP數據庫、千人數據庫、EXAC數據庫中正常對照人群中未發現該突變。綜合分析患兒臨床表型、突變位點，以及其父母雙方的全外顯子測序結果，最終確定該突變為該家系的致病突變。

表1 患兒全外顯子測序檢測相關突變結果及突變來源

2.2 患兒及胎兒Sanger測序結果 患兒檢出SGSH基因的NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)純合突變，其父母均為該突變的雜合攜帶者。明確該家系致病位點后，抽取羊水對胎兒進行Sanger測序，結果提示胎兒為該突變的雜合攜帶者。先證者及胎兒的測序結果對比見圖1。

圖1 SGSH基因Sanger測序結果

2.3 胎兒染色體核型分析及染色體微陣列分析結果 因孕婦38歲，為高齡孕婦，故詳細遺傳咨詢后，在知情同意的前提下，除進行胎兒SGSH基因檢測外，同時對胎兒進行了染色體核型分析及染色體微陣列分析。胎兒染色體核型分析結果為46,XN，染色體微陣列分析結果未發現已知具有明確臨床致病意義的拷貝數變異。

3 討論

3.1 全外顯子測序明確家系致病原因 2011年，WORTHEY等[11]第一次將全外顯子測序成功應用于一名嬰兒，對其進行了罕見炎性腸病突變位點的臨床診斷，相關檢測結論對該名嬰兒的后期治療產生了非常積極的影響。目前全外顯子測序在二代測序技術中擁有非常大的優勢：(1)與全基因組測序相比，全外顯子測序在基因組中所占比例約為2%[12]，所占比例很小，故具有更好的目標區域覆蓋率；(2)因其所需分析的數據較少，故數據分析更簡便，也具有更低的價格；(3)全外顯子測序技術還具有高通量、高準確性以及高速度等特點。正因為有這些優勢，全外顯子測序技術已被越來越多的臨床醫生接受，并應用于臨床診斷[4]。尤其在2016年，一項涉及54個國家1 000個家庭的研究表明，對非特異性或異構表型的疾病而言，全外顯子測序是一種有效的診斷工具[13]。綜合國內外文獻，多數研究人員認為，全外顯子測序對未確診疾病的診斷率比經典遺傳診斷方法更高。在國外，甚至已經有研究人員呼吁將全外顯子測序作為未確診疾病的一線診斷工具，以便能給患者帶來更好的醫療護理，但目前還沒有形成相關的臨床共識，也沒有相關的臨床指南出臺。本研究中，患兒表現為進行性加重的智力低下，聽力下降，語言發育落后，只能發單音，頭部狹長，這些臨床表型均為非特異性，且該患兒也未進行相關檢測，診斷不明。此外，患兒已有一個表型正常的同胞姐姐，家族中沒有與患兒相似的病例。在沒有特異性的臨床表型，也沒有家族史的情況下，臨床很難對其明確診斷。患兒母親已經孕16+周，要對胎兒進行診斷，迫切需要考慮到時間效益和經濟效益，需要尋求一次性、全面性的遺傳學檢測方法。結合國內外文獻資料，臨床認為該患兒符合全外顯子測序的應用指征[13-14]。在經過詳細遺傳咨詢、患兒父母知情同意的前提下，應用全外顯子測序技術對該家系進行突變分析。筆者發現并篩選出了多個變異位點，通過查閱相關數據庫及文獻，綜合患兒臨床表型及其父母全外顯子測序結果分析，明確了患兒致病原因為MPSⅢA相關SGSH基因NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)純合突變導致SGSH缺陷而致病，同時明確患兒父母為該位點雜合突變攜帶者。此外，用Sanger測序對全外顯子測序結果進行了驗證。最終對患兒母親行羊膜腔穿刺術抽取羊水，對胎兒進行MPSⅢA相關的SGSH基因同一位點的突變檢測，明確胎兒為該位點的雜合突變攜帶，有效避免了該家系再次出生MPSⅢA患兒。患兒母親年齡為38歲，屬于高齡孕婦，為避免染色體病患兒出生，在進行胎兒MPSⅢA相關的SGSH基因突變檢測的同時，也同時進行了染色體核型分析及染色體微陣列分析。

3.2 MPSⅢA的預后及治療 2018年黏多糖貯積癥被列入我國國家衛生健康委員會、科技部等五部門聯合發布的《第一批罕見病》中，該病分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ型等7種，國內報道較多的是Ⅰ型和Ⅱ型[15-16]。MPSⅢ型在國內尤為罕見,發病率尚無報道。MPSⅢA型屬于Ⅲ型中最嚴重的一種類型，是由于SGSH缺陷，使硫酸乙酰肝素不能降解而在細胞內積聚，從而導致進行性多系統損害，特點為發病早、生存期短、病情惡化快。臨床主要表現為中樞神經系統嚴重退化，但只有輕微的軀體障礙，通常在2～6歲之間開始表現出臨床癥狀，大多數患者在6～10歲時會出現嚴重的神經系統退化。本研究明確了患兒的致病突變位點，回顧分析其臨床表型時，發現與MPSⅢA的臨床表型是相符的。基因水平病因的明確為正確評估患兒將來的臨床預后起到了重要作用。

對于MPS患兒的治療，目前缺乏徹底根治的方法，僅僅是對癥治療。最有希望的治療方法是特異性的酶替代治療及基因治療，兩者可改善患兒的臨床表現以及生存情況，且目前已有酶替代治療進入臨床階段[17]。但MPSⅢ型是一個困難的挑戰，因為與其他型別的MPS不同，MPSⅢ型患者主要表現為嚴重的神經退行性改變，故該型的治療中酶作用的主要目標是中樞神經系統。因為血腦屏障存在，即使血液中的酶濃度很高，也不能有效的穿過血腦屏障到達中樞神經系統起作用。目前，國內外還沒有批準的MPSⅢ酶替代治療方法，但國外已有研究團隊開發了針對MPSⅢ的腺相關病毒載體介導的基因治療策略[17]，相信在不久的將來MPSⅢ患兒也能接受有效的基因治療。

綜上所述，SGSH基因c.703G＞A(p.Asp235Asn)是該黏多糖貯積癥Ⅲ型家系的致病原因，可以根據該致病突變對家系中的攜帶者進行產前診斷，避免再次出生黏多糖貯積癥Ⅲ型患兒。且根據檢測結果，能對家系中已有的MPSⅢA患兒進行準確的臨床預后及相應治療的評估。