尾加壓素Ⅱ促進毛乳頭細胞增殖和遷移的實驗研究

廖叢娟，張旭升，樊小容，譚小青，黃戰軍，蔡博治

1.深圳市龍崗區人民醫院皮膚科，廣東 深圳 518172；2.汕頭大學醫學院第一附屬醫院中心實驗室，廣東 汕頭 515000

尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)是一種生長抑素樣環肽，最初是從魚脊髓尾部腦垂體中分離而來，1998年首次從人脊髓中被克隆，是迄今為止發現的體內最強的縮血管活性肽，在體內具有影響脂質和葡萄糖代謝、刺激腎上腺皮質激素分泌等作用[1]。近年來研究發現，UⅡ是一種內源性促絲裂原，可促進體外培養的包括血管平滑肌細胞[2]、氣道平滑肌細胞[3]、心臟成纖維細胞[4]、腎小球系膜細胞[5]在內的多種細胞分裂的作用。但UⅡ對體外培養的毛乳頭細胞的增殖以及遷移的影響尚未見報道。本實驗主要研究UⅡ對體外培養的毛乳頭細胞生長及遷移的影響，并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 SPF級雄性SD大鼠由汕頭大學醫學院實驗動物中心提供。DMEM高糖培養基、標準胎牛血清購自Gibco公司。胰蛋白酶購自Sigma公司。UrotensinⅡ(Rat，200 μg)購自康肽生物有限公司。CCK-8購自碧云天生物科技有限公司。Transwell 0.8 μm小室購自美國康寧公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠毛乳頭細胞培養 將大鼠處死，取觸須部皮膚，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈，用顯微剪分離出觸須毛囊，放置于生理鹽水中，將觸須毛囊毛球部剪下，用Ⅰ型膠原酶消化2 h左右，在鏡下觀察到大量的毛乳頭細胞游離出來，用含10%血清的DMEM培養基終止消化。離心去上清，將毛乳頭細胞放入T25培養瓶中，37℃5%CO2條件下傳代培養。實驗用第2～4代細胞。

1.2.2 UⅡ對體外培養的毛乳頭細胞增殖的影響 將第2～4代細胞消化、臺盼藍染活細胞計數，以3×103/孔的密度接種于96孔板內，放置于培養箱內培養24 h，待細胞貼壁后，每孔加入100 μL含不同濃度UⅡ的DMEM培養基，UⅡ的濃度分別為10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L，對照孔加入不含UⅡ的培養基，每個濃度設3個復孔。以鋪板24 h記為測量的0 h，于48 h采用CCK8法測量各孔的OD值。測量時去除每孔的原培養液，懸空滴加含10%CCK8的新鮮培養基，于培養箱中放置1 h后，在酶標儀上測量波段為450 nm的OD值。細胞增殖率計算公式：增殖率=(含UⅡ實驗孔OD值-空白對照孔OD值)/(不含UⅡ對照孔OD值-空白對照孔OD值)×100%。

1.2.3 Transwell實驗檢測UⅡ對毛乳頭細胞體外遷移能力的影響 提前將細胞用不含血清的培養基饑餓培養12 h后，消化、計數，制備成1.0×106/mL的細胞懸液，往Transwell上室中接種0.1 mL細胞懸液，下室加入含10-6mol/L UⅡ的DMEM培養基500 μL，對照孔加入不含藥培養基。于5%CO2培養箱內孵育24h后取出上室，用棉簽輕輕拭去上室濾膜內面的細胞，對遷移至濾膜外面的細胞用甲醇在室溫條件下固定20 min，結晶紫染色后，隨機取4個視野(40倍鏡)記錄著色的細胞數。

1.2.4 細胞劃痕實驗檢測UⅡ對毛乳頭細胞體外遷移能力的影響 將毛乳頭細胞接種至12孔板內，使細胞增殖至融合度為90%，使用無菌0.2 mL移液器套頭筆直在細胞上劃出一條傷痕，用PBS洗去死細胞，加入1 mL含10-6mol/L UⅡ的DMEM培養基，對照孔加入不含藥培養基。在劃痕后0 h和24 h拍照，在每條傷痕上隨機選3個地方，用Image-Pro Plus軟件測量直徑后取平均數。創面閉合指數計算方法：24 h創面閉合指數=(0 h直徑-24 h直徑)/0 h直徑×100%。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.0統計軟件分析數據，計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 UⅡ對毛乳頭細胞增殖的影響 如圖1所示，不同濃度UⅡ (10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L)作用下，CCK8法測得的毛乳頭細胞增殖率分別為(122±12.3)%、(141±4.4)%、(136±16.6)%、(137±15.6)%、(116±10.9)%、(109±10.8)%，其中10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L UⅡ顯著促進毛乳頭細胞增殖，分別與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。

圖1 CCK8法檢測UⅡ對體外培養的毛乳頭細胞增殖的影響

圖2 Transwell法檢測UⅡ對毛乳頭細胞遷移能力的影響(×100)

2.2 UⅡ對毛乳頭細胞遷移的影響 如圖2A～2C所示，加藥組的Transwell濾膜結晶紫染色結果明顯比未加藥組深，通過IPP軟件計算著色的細胞數，結果顯示加藥組穿過Transwell濾膜的細胞數明顯多于對照組(圖2D)，說明10-6mol/L和10-7mol/L的UⅡ處理組都能顯著促進毛乳頭細胞遷移，分別與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。在劃痕實驗中，傷口愈合程度不同代表不同實驗組細胞遷移程度的差異。如圖3所示，隨著時間延長，各組細胞的傷痕平均直徑都越來越小。但是對照組的愈合程度明顯低于UⅡ組，根據愈合指數計算，對照組及10-6mol/LUⅡ組24 h創面愈合指數分別為0.18±0.13、0.78±0.09，其中10-6mol/L UⅡ組明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，說明UⅡ可促進毛乳頭細胞遷移。

圖3 劃痕實驗檢測UⅡ對毛乳頭細胞遷移能力的影響(×100)

3 討論

位于毛囊基底部的毛乳頭細胞可誘導上皮細胞增殖分化形成毛囊，在毛發生長周期中起著重要的誘導、分化、維持和調節作用，對男性脫發癥的發生和發展影響重大[6]。研究發現，將體外培養的毛乳頭細胞移植入裸鼠體內，可誘導出大量毛囊和毛發纖維，形成肉眼可見的毛發，提示毛乳頭細胞是產生毛發的關鍵細胞[6-7]。因此毛乳頭細胞的體外分離培養及生物學特性是值得關注的。

許多研究證實，UⅡ對多種類型的細胞具有促增殖效應，WATANABE等[8]報道，UⅡ可促進血管平滑肌細胞中3H-胸腺嘧啶摻入，該刺激呈濃度依賴性，在UⅡ濃度為50 nmol/L時達最大效應，禹曉童等[9]發現UⅡ可通過介導肝臟干細胞內活性氧的水平從而促進細胞增殖，汪華林等[10]發現UⅡ通過影響細胞內鈣離子濃度從而激活鈣調速、蛋白激酶C、絲裂原活化蛋白激酶等多條途徑，促進乳鼠腎小球系膜細胞增殖。這些研究均提示UⅡ是重要的促絲裂原，可通過多種機制誘導細胞增殖。另外，前期研究發現UⅡ具有促進血管外膜成纖維細胞遷移的能力[2]。然而UⅡ對毛乳頭細胞增殖和遷移能力的影響目前尚未見報道。

本實驗采用體外分離、培養的大鼠毛乳頭細胞，進行CCK8實驗、Transwell實驗和劃痕實驗，觀察不同濃度的UⅡ對毛乳頭細胞增殖和遷移的影響。本實驗的研究結果提示，一定濃度范圍內的UⅡ可促進毛乳頭細胞增殖，其特點是隨著UⅡ干預濃度的升高，毛乳頭細胞存活率呈現先增加后降低的趨勢，其中10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L UⅡ顯著促進毛乳頭細胞增殖，上述結果與何艷華等報道的一定濃度的UⅡ可促進體外培養的大鼠心臟成纖維細胞增殖且促增殖能力隨濃度先增加后降低的結論一致[11]。同時Transwell實驗結果顯示10-6mol/L、10-7mol/L UⅡ可促進毛乳頭細胞遷移。在劃痕實驗中，10-6mol/L UⅡ組的細胞在24 h幾乎達到完全愈合，愈合指數高達0.78，而對照組在48 h的愈合指數僅為0.18，差異具有統計學意義。由此可見，UⅡ不僅能促進毛乳頭細胞增殖，也可以促進毛乳頭細胞遷移。

綜上所述，本研究以尾加壓素Ⅱ作為干預因素，證明尾加壓素Ⅱ能促進毛乳頭細胞生長、增殖，還可提高毛乳頭細胞的體外遷移能力，為揭示UⅡ的生物學效應提供新證據，為臨床防治脫發提供一種新的策略與靶點。