基于生物膜干涉技術(shù)的單克隆抗體高通量定量檢測方法的建立

胡 妍， 羅 安， 車耀健， 劉全裕

單克隆抗體因特異性強(qiáng)、療效顯著，其應(yīng)用正在逐步改變腫瘤治療局面[1]。通常采用瞬轉(zhuǎn)或者穩(wěn)轉(zhuǎn)的方式可獲得能分泌高效單克隆抗體的細(xì)胞株，且在挑選細(xì)胞株過程中需要對細(xì)胞表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測[2-4]。

生物膜干涉(bio-layer interaction，BLI)技術(shù)是基于光干涉信號實(shí)現(xiàn)對生物分子快速檢測的非標(biāo)記分析檢測技術(shù)，其原理為：生物傳感器底端由生物膜層覆蓋，當(dāng)生物膜層與另外一種分子接觸后，生物膜層厚度增加，接觸后，光干涉光譜位移在傳感器膜層發(fā)生變化，通過監(jiān)測位移變化，對樣品濃度進(jìn)行定量[5]。與其他蛋白檢測方法相比[6-7]，BLI方法具有實(shí)時提供分析物信息、分析速度快和樣品耗量少等優(yōu)點(diǎn)[8]。Octet是基于BLI原理發(fā)展起來的商業(yè)化設(shè)備，該儀器還具有能實(shí)現(xiàn)無損檢測的優(yōu)勢[9]。

抗體可根據(jù)結(jié)構(gòu)中是否含有Fc片段進(jìn)行分類[10-11]，從而選擇不同類型的生物傳感器進(jìn)行含量測定。protein A 生物傳感器能與單克隆抗體上的Fc段特異性結(jié)合[12-13]，采用浸入即讀式模式對單克隆抗體進(jìn)行濃度測定。本研究運(yùn)用BLI技術(shù)，建立單克隆抗體高通量濃度定量方法，并對該檢測方法進(jìn)行方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 分子相互作用分析儀(Octet Red 96，包括自動操作和數(shù)據(jù)分析軟件，美國Pall公司)，手持式pH測量儀(SG 23，梅特勒-托利多儀器公司)，電子分析天平(Practum 124-1CN，德國賽多利斯公司)。

1.1.2試劑 自制的單克隆抗體的工作標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.6%)、雙價單鏈抗體(diabody)的工作標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.8%)由本單位提供，protein A生物傳感器(批號：1812082，美國Pall公司)，96孔板(批號：E17023P8，美國Greiner bio-one公司)，CD-CHO培養(yǎng)基(批號：2066133，美國Gibco公司)，磷酸鹽緩沖溶液(批號：10817010，美國Corning公司)，甘氨酸(批號：SLBN5537Y，美國Sigma公司)，鹽酸(批號：20180122，中國國藥公司)，吐溫-20(MKBS1669V，美國Sigma公司)，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-pore超純水。

1.2方法

1.2.1溶液配制 中和液：取100 μL吐溫-20溶液加至500 mL PBS緩沖液中，混勻；再生液(10 mmol/L甘氨酸，pH 1.7)：稱取75 mg甘氨酸，加水溶解并定容至100 mL，滴加鹽酸將溶液pH調(diào)至1.7。

1.2.2檢測條件 檢測溫度30 ℃，樣品盤轉(zhuǎn)速400 r/min，樣品與生物傳感器定量結(jié)合時間120 s，再生時間5 s，中和時間5 s，樣品或溶液量每孔200 μL。

1.2.3檢測過程 protein A傳感器在再生液中浸泡5 s，中和液中浸泡5 s，中和、再生步驟重復(fù)3次，再在樣品溶液中浸泡120 s，對樣品進(jìn)行定量檢測，最后重復(fù)中和、再生步驟3次，用于再生和平衡傳感器。

1.2.4方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1方法的專屬性試驗(yàn) 取表達(dá)單克隆抗體的培養(yǎng)基、細(xì)胞上清和diabody標(biāo)準(zhǔn)品3種樣品，加至96孔板中，按照1.2.2的檢測條件進(jìn)行檢測。

1.2.4.2回歸關(guān)系考察 取500 μg/mL的單克隆抗體工作標(biāo)準(zhǔn)品，用平衡液將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，制得7.81～500 μg/mL共7個濃度的溶液，采用1.2.2檢測條件進(jìn)行分析。

1.2.4.3檢測限和定量限 將單克隆抗體的工作標(biāo)準(zhǔn)品不斷稀釋，采用1.2.2的檢測條件分析，以信噪比(s/n)=3時的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢測限，以s/n=10時的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為定量限。另配制6份最低定量限濃度的溶液，測定樣品濃度并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.4.4準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn) 按細(xì)胞上清與標(biāo)準(zhǔn)品體積比分別為0.5∶1，1∶1，1.5∶1的比例配制3份樣品，每份樣品重復(fù)3孔，采用1.2.2的檢測條件進(jìn)行定量分析，計(jì)算9份樣品的回收率。取細(xì)胞上清，重復(fù)6孔，加至96孔板中，進(jìn)行定量分析，計(jì)算6個樣品的精密度。由實(shí)驗(yàn)室另外兩名實(shí)驗(yàn)人員按照溶液配制方法配制溶液并按照檢測條件和檢測步驟各對6份細(xì)胞上清進(jìn)行定量檢測，計(jì)算12份樣品的中間精密度。

1.2.4.5溶液的穩(wěn)定性和耐用性試驗(yàn) 進(jìn)行不同批次樣品濃度測定時，每次在96孔板中加入150 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為陽性對照，得出每次陽性對照的實(shí)際值，并計(jì)算RSD以考察溶液的穩(wěn)定性。取表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞上清，按照1.2.2的檢測條件測定，記錄樣品濃度值，再分別記錄再生液pH變化±0.2、平衡液吐溫-20比例變化±5%、檢測溫度變化±5 ℃、轉(zhuǎn)盤速度變化±20%時樣品濃度值[14]，每個變化條件下重復(fù)2孔，總共16次，計(jì)算這16次樣品濃度的RSD。

1.2.4.6UPLC檢測試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[15]方法，使用Waters UPLC超高效液相色譜儀、protein A色譜柱；檢測條件為：柱溫30 ℃、檢測波長280 nm；進(jìn)樣體積為10 μL；流動相A(10 mmol/L PBS含0.15 mol/L NaCl, pH 7.2)-流動相B(0.15 mol/L NaCl, pH 2.6)進(jìn)行梯度洗脫，流速0.5 mL/min，進(jìn)而對單克隆抗體含量進(jìn)行檢測。

1.2.4.7Octet檢測數(shù)據(jù)與UPLC-protein A檢測結(jié)果的比較試驗(yàn) 取已培養(yǎng)14 d的細(xì)胞上清溶液，分別使用Octet和UPLC檢測方法進(jìn)行定量檢測，比較兩種定量方法的檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1方法的專屬性結(jié)果 protein A傳感器在表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞上清中能產(chǎn)生結(jié)合信號，在diabody標(biāo)準(zhǔn)品溶液及CD-CHO培養(yǎng)基中不產(chǎn)生結(jié)合信號，結(jié)果見圖1。單鏈抗體、培養(yǎng)基樣品的相對干涉光譜位移變化幾乎為0(bingding)，而表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞上清隨著結(jié)合時間增加，厚度也隨之增加，表明protein A能特異性結(jié)合有Fc段的單克隆抗體，結(jié)合過程中不受其他類型干擾物質(zhì)的影響。

2.2擬合結(jié)果 隨著單抗工作標(biāo)準(zhǔn)品濃度降低，其在protein A傳感器表面結(jié)合減少，使得傳感器末端厚度減小，經(jīng)計(jì)算，結(jié)合速率與濃度呈良好的擬合關(guān)系，決定系數(shù)R2為0.999 9。結(jié)果見圖2。

2.3檢測限和定量限 當(dāng)s/n=3時，單克隆抗體的檢測限為0.6 μg/mL；當(dāng)s/n=10時，單克隆抗體的檢測限為2 μg/mL。6份2 μg/mL的單抗溶液的RSD為2.34%。

2.4準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)公式：

回收率=(加入標(biāo)品后含量-樣品含量)/加入標(biāo)品量×100%

細(xì)胞上清與標(biāo)準(zhǔn)品分別為0.5∶1，1∶1，1.5∶1的體積比混合定量后，工作標(biāo)準(zhǔn)品的回收率98.90%～100.40%，說明該方法檢測單克隆抗體準(zhǔn)確度高，結(jié)果見表1。通過樣品的重復(fù)性考察，得RSD為2.17%，中間精密度的RSD為2.52%，說明運(yùn)用BLI技術(shù)定量檢測方法精密度高(表2)。

表1 樣品不同添加量的回收率

表2 精密度檢測結(jié)果

2.5溶液的穩(wěn)定性和耐用性試驗(yàn)結(jié)果 使用相同的protein A生物傳感器，樣品隔5，15，25，30和45 d分別進(jìn)樣，150 μg/mL的陽性對照樣品測試值分別為155.2，141.8，147.7，148.1，148.2 μg/mL。經(jīng)計(jì)算，陽性對照濃度值的RSD為3.7%，protein A生物傳感器重復(fù)使用60次，說明樣品溶液穩(wěn)定、傳感器可重復(fù)利用次數(shù)多。根據(jù)耐用性試驗(yàn)方法，每個變化條件下重復(fù)進(jìn)樣2次，總計(jì)16次。再生液甘氨酸pH變化±0.2、平衡液吐溫-20比例變化±5%的RSD值為0.99%，甘氨酸pH值、PBST溶液中吐溫-20含量的變化不影響檢測方法的耐用性(表3)。

表3 耐用性檢查結(jié)果

檢測溫度變化±5 ℃、轉(zhuǎn)盤速度變化±20%是影響樣品定量檢測的因素，轉(zhuǎn)盤速度變化-20%時對檢測結(jié)果影響最大(表4)。檢測溫度和轉(zhuǎn)盤速度的改變影響樣品與protein A傳感器的結(jié)合速率，從而影響定量結(jié)果。

表4 考察結(jié)果的影響因素

2.6Octet檢測結(jié)果與UPLC-protein A檢測結(jié)果的差異 分別使用Octet和UPLC-protein A兩種方法檢測25個細(xì)胞上清的表達(dá)量，Octet檢測結(jié)果與UPLC-protein A結(jié)果高度一致(R2=0.90)(圖3)。

3 討 論

在篩選高產(chǎn)、穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株的過程中，需快速、準(zhǔn)確地對挑選的細(xì)胞進(jìn)行定量檢測，以便對細(xì)胞株進(jìn)行篩選和排序;在挑完克隆進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)時，需對蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測與監(jiān)控。本研究運(yùn)用BLI技術(shù)，使用Octet分子相互作用分析儀和protein A生物傳感器，能實(shí)現(xiàn)對單克隆抗體高通量定量檢測。該種定量方法具有很多突出的優(yōu)勢，如：樣品適用性強(qiáng)，分析過程不受各類培養(yǎng)基及雜質(zhì)影響；分析前，樣品不需進(jìn)行復(fù)雜的前處理步驟，收到樣品可立即檢測；分析樣品用量少、可回收；與UPLC-protein A結(jié)果比較，檢測時不需要每次都建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，節(jié)省工作標(biāo)準(zhǔn)品的消耗；UPLC-protein A檢測一個樣品需要10 min，該種定量方法能一次檢測8個樣品，每次檢測耗時約2.5 min，能在30 min檢測80個樣品的濃度，分析速度提高了27倍，實(shí)現(xiàn)對樣品的高通量檢測。

本研究運(yùn)用BLI技術(shù)，建立了高通量定量檢測單克隆抗體的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，主要考察了專屬性、線性、檢測限和定量限、準(zhǔn)確度、精密度和中間精密度、溶液穩(wěn)定性、系統(tǒng)耐用性。結(jié)果表明，protein A傳感器能特異性地與單克隆抗體結(jié)合，不受其他雜質(zhì)干擾，抗體的濃度與結(jié)合速率之間呈良好的回歸關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9；檢測限為0.6 μg/mL，定量限為2 μg/mL；該方法準(zhǔn)確度高；重現(xiàn)性好；再生液pH、平衡液吐溫-20比例變化不影響檢測系統(tǒng)的耐用性，檢測溫度、轉(zhuǎn)盤速度變化是影響樣品定量檢測的因素。

本研究建立的高通量定量檢測單克隆抗體濃度的方法，符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，濃度測定結(jié)果與UPLC-protein A結(jié)果相比，有很好的可比性，同時省去樣品前處理過程，操作更簡便。在挑選高產(chǎn)細(xì)胞株時，該方法能準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行定量檢測，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞株進(jìn)行篩選、排序以及蛋白表達(dá)的檢測與監(jiān)控。