兩種局灶性腦缺血大鼠模型的影像及超微結構比較

李鉆芳, 李 樂, 楊敏光, 梁勝祥, 黃云梅, 林如輝

腦缺血是常見的臨床疾病，嚴重威脅人類健康。隨著基礎研究的不斷深入，出現許多腦缺血動物模型。其中大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型使用最為廣泛[1-3]，而光化學法誘導腦缺血模型則與臨床血栓形成機制更相似[4-5]。本研究制作大鼠MCAO與光化學誘導腦缺血兩種模型，結合小動物磁共振成像技術，比較兩種大鼠缺血模型缺血區影像學及超微結構的差異，為腦梗死溶栓治療研究提供動物模型選擇的實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 雄性SD清潔級大鼠36只[上海斯萊克實驗動物有限責任公司]，鼠齡2.5月齡，于福建中醫藥大學實驗動物中心飼養至(250±30)g [許可證號：SYXK(閩)2005-004]。所有大鼠飼養在獨立通氣系統實驗室，具有獨立換氣系統，維持24 ℃恒溫，光照周期為12 h開/12 h關，自由進食、取水。

1.1.2試劑 戊二醛(中鏡科儀廣州分公司)，四氧化鋨(中鏡科儀廣州分公司)，異氟烷、MCAO線栓(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，玫瑰紅(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3實驗儀器 超導型核磁共振成像系統(7.0 T，德國布魯克公司)對大鼠頭顱進行T2加權成像(T2WI)、磁敏感加權成像(SWI)掃描，其中磁共振儀器的線圈為大鼠專用頭部線圈。透射電鏡(H-7650，日本Hitach 公司)，超薄切片機(UC-6，德國 Leica 公司)。腦立體定位儀(68001，深圳瑞沃德生命科技有限公司)，顱骨鉆(78001，深圳瑞沃德生命科技有限公司)，532nm激光器(HW532AD300-100F，深圳市紅外線激光科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1MCAO大鼠模型(MCAO模型組)的建立 術前18只大鼠均禁食12 h。在室溫條件下，參照文獻[1]方法行左側MCAO手術。腹腔注射水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，仰臥位固定，頸部皮膚消毒剃毛，正中切開頸部皮膚及皮下組織，鈍性分離左側頸總動脈(arteria carotis communis，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)及頸內動脈(internal carotid artery，ICA)。結扎CCA近心端及ECA，用微動脈夾夾閉遠端ICA。在CCA上近分叉處約5 mm處剪一“V”型小口，將線栓經CCA插入ICA，直至有少許阻力感，即阻斷大腦中動脈入口處(從ECA與ICA分叉處起計算，約插入18～22 mm)，結扎ICA，傷口常規縫合。1.5 h后緩慢退出線栓，使血流再灌注，造模完成[6]。

1.2.2光化學誘導大鼠腦缺血模型(光化學誘導模型組)的建立 術前18只大鼠均禁食12 h。腹腔注射水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，呈俯臥狀態，頭部固定在腦立體定位儀上，環境溫度保持于(25.0±0.5)℃，手術野的溫度控制于(37.0±0.5)℃。在眼外眥和外耳道連線中點垂直切開皮膚約1.2 cm，暴露顳骨，使用直徑2.1 mm的圓形顱鉆于顴骨與顳骨鱗部接合、靠右1 mm處開直徑為0.3 cm的顱窗，打磨過程中用生理鹽水反復沖洗創面，消除機械熱及殘骨渣[4]。90 s 內尾靜脈緩慢注射玫瑰紅(20 mg/kg)，10 min后將波長532 nm 激光(30 mW)調節為覆蓋手術區的圓形投射影，照射20 min，常規縫合傷口即完成光化學腦梗死模型制作[4]。

1.2.3MRI檢測大鼠腦影像結構 各組大鼠在造模24 h后行T2WI及SWI掃描。大鼠俯臥位，配合呼吸麻醉系統，掃描成像時全程通以適量比例的異氟烷與氧氣，并實時監控大鼠的呼吸狀態。采用水溫循環系統保證大鼠的生理溫度。

結構T2WI采用弛豫增強快速采集(RARE)序列，重復時間TR 2 600 m，回波時間TE 33 ms，層厚0.8 mm，層間距0 mm，層數21，視野(FOV) 35 mm×35 mm，矩陣 256×256，反轉角(FA)180°，重復次數分別為4次，掃描時間5 min 23 s。微血管成像采用SWI-FLASH(磁敏感快速小角度激發成像)序列，TR 600 ms，TE 20 ms，層厚0.6 mm，層數18，FA 30°，FOV 30 mm×30 mm，矩陣384×384，掃描時間14 min 46 s。

1.2.4透射電鏡觀察腦超微結構 所有大鼠經磁共振檢測后腹腔注射3 mL/kg水合氯醛進行麻醉，打開頭蓋骨后迅速原位固定腦組織，于皮質缺血區邊緣及對側正常組織各取3塊約1 mm3的小塊放入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定48 h(4 ℃)，PBS充分漂洗后，經1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定2 h，再經PBS漂洗；酒精-丙酮梯度脫水，環氧樹脂618包埋。半薄切片定位后以90 nm超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，在透射電子顯微鏡80 kV下觀察、攝片。

2 結 果

2.1影像學觀察結果 T2WI圖像上可見MCAO模型組大鼠皮質缺血區范圍較大，波及紋狀體，部分大鼠整個半腦缺血；光化學誘導模型組大鼠缺血區范圍較小，穩定在激光照射區附近，大腦其他區域未受影響。缺血體積統計顯示，MCAO模型組梗死區體積為(32.53±21.36)%，而光化學誘導模型組梗死區體積僅為(3.32±2.13)%，兩組比較，差別有統計學意義(P<0.05)。

SWI成像顯示，MCAO模型組大鼠皮質缺血區微血管較小，僅個別大血管暢通，而光化學誘導模型組大鼠缺血區附近存在大量微小血管，提示其血腦屏障存在恢復狀態。

2.2超微結構觀察結果 各模型組大鼠對側正常區神經細胞呈橢圓形，細胞膜完整，表面有較豐富細胞突起；細胞核呈圓形，染色質分布均勻，無明顯邊聚或腫脹現象，核仁明顯；細胞內有豐富的粗面內質網，線粒體較多，糖元豐富，血管內皮細胞完整。MCAO模型組缺血區與正常結構相比，神經細胞變形，體積縮小，表面突起減少，邊界不清；細胞核體積縮小，電子密度增加，染色質分布不均，部分呈邊聚現象；線粒體體積縮小，偶見溶酶體，粗面內質網體積縮小，脫顆粒現象明顯；血管變形明顯，偶見內皮細胞，血管周圍腫脹。光化學誘導模型組的造模缺血區神經細胞邊界不清，細胞膜部分破損，細胞核呈橢圓形，染色質分布不均，電子密度低，呈輕微腫脹，線粒體結構破損、嵴呈斷裂現象，粗面內質網結構腫脹，脫顆粒現象明顯；部分血管內皮細胞腫脹，血管周圍水腫明顯，部分組織溶解。

3 討 論

腦缺血動物模型對于研究人類腦缺血損傷的病理生理機制及評估其干預手段具有重要的參考價值。MCAO模型為經典的腦缺血動物模型，應用最廣泛，因其不需要開顱、可準確控制缺血和再灌注時間等特點，對研究藥物療效以及再灌注損害和治療時間窗等方面較為理想[5]。但因不同造模操作者的熟練程度不同、線栓穿插深淺的差異等原因，最終造成大鼠缺血區大小不一，造模后大鼠存活率下降，難以保證只有特定區域(如皮質區)發生缺血，因此在科研實驗中存在一定的局限性。而光化學誘導動物模型的血栓形成部位可以隨意控制，準確定位，方法操作簡便，動物存活率高，對動物的損傷相對較小，穩定性和重復性也較好[7]；但其需要開顱，這在一定程度上破壞了顱內結構的完整性，故而影響了其實用價值。

在判斷腦缺血造模結果方面，腦組織厚片TTC染色是常用的方法[8]，但因其需處死動物，故不利于后續實驗研究。近年來，小動物磁共振成像技術逐漸興起。該方法可直接顯示缺血區所在的部位、大小、范圍，成像分辨率高，且為非侵襲性檢查手段。如果結合各腦區結構及功能分析，對于干預效應的機制研究具有重要作用。同時，利用磁共振的多參數成像可以更仔細地了解神經血管的狀態，并可為干預和評價提供客觀的影像資料[9]。

本研究結果顯示，傳統的造模方法造成的梗死灶范圍較大，水腫面積大，在一定程度上波及皮質、海馬區外的腦區。這些腦區的改變將影響神經細胞或膠質細胞結構的改變，進一步影響其功能的發揮。這些非實驗預期的改變，可以通過小動物磁共振預先發現，及早處理可避免后期進一步干擾相關實驗指標的檢測。同時，可以讓科研人員及時調整或改進造模方式，在某種程度上也可減少預實驗的時間，為后期客觀的實驗結果奠定基礎。

機體中腦血管網最完善，血管與血管之間以側支溝通以保證腦的氧和葡萄糖供應[10]。一旦血管堵塞，缺血損傷的大小及發展速度與所累及部位的側支供血潛力密切相關[11]。本研究結果也顯示，MCAO造模后大腦中動脈供血深部區域缺乏側支循環，內囊與紋狀體的梗死明顯早于具有豐富側支的皮質，造成大范圍的缺血[12]。而光化學誘導缺血造模不會波及內囊及紋狀體，缺血及缺血區的恢復僅局限在光照區域，腦內大部分區域結構均未受破壞。大多數神經細胞于腦缺血發生后幾小時內變性壞死，而新生血管則需要幾天的時間生成，因此血管新生之前很多神經細胞均已壞死消失[13]。本研究磁共振成像也顯示，兩種缺血模型缺血邊緣區均存在不同程度的血管新生。

目前國內外研究缺血性腦損傷的動物模型中，應用MCAO比較多，應用光化學誘導相對較少。Choi等比較了MCAO與光化學誘導模型動物的神經行為缺陷與動物模型腦梗死體積的關系[14]，結果顯示MCAO模型大鼠腦總梗死體積呈時間依賴性增加，神經功能評分和行為缺陷與梗死體積呈正相關；而光化學誘導模型大鼠腦梗死體積相對平穩，無時間依賴性增加，梗死體積與神經行為異常的相關性較差。Yang等結合光學相干斷層成像技術研究光化學誘導模型在缺血性梗死血管空間、血管神經元的功能恢復等研究中的獨特作用，結果顯示缺血損傷后遠端大、中腦動脈能自發性再通，小腦皮質微血管伴隨著新出現的血管從外周進入核心區呈再灌注狀態，而皮質毛細血管恢復能力較差[15]。

本研究同時從亞顯微水平比較兩種造模方法的差異。MCAO造模造成腦內神經組織炎癥反應，大量神經細胞及神經膠質細胞水腫，血管內皮腫脹，血腦屏障破壞嚴重，通透性增加，梗死灶范圍較大，成活率降低，模型成功率大大下降。光化學誘導法導入的光敏物質易形成血栓，引起微血管損傷，造成動脈閉塞，觀察全身血液循環系統變化較困難；可能出現內皮細胞損害、血腦屏障損壞和血管源性腦水腫等病理變化；或者因大鼠自身具有恢復能力，可能無法進行長時間的實驗觀察和療效驗證。但光化學誘導血栓模型缺血范圍較小且穩定，神經細胞腫脹較小，血管炎性滲出減少，血腦屏障破壞相對較少。結合磁共振影像和超微結構分析，此兩種造模方法各有優缺點，MCAO模型較適合長期實驗的觀察研究，適用于與功能恢復有關的預防、血管損傷保護或治療化合物的研究；光化學誘導模型適合急性期或針對特定腦區的干預機制研究，有助于聚焦病灶導致位置相關的行為改變等研究。