無創產前篩查技術的臨床效能分析

馬 瑩，盧彥平，高志英，謝瀟瀟，游艷琴，周紅輝，馮秀麗，王秀娟，張亞青，姜淑芳解放軍總醫院第一醫學中心 婦產科，北京 0085；北京市豐臺區婦幼保健院，北京 00069；北京航天總醫院，北京 00076；北京市門頭溝區婦幼保健院，北京 000

無創產前篩查(non-invasive prenatal test，NIPT)狹義上是指通過高通量基因測序技術對母體外周血內游離DNA測序，檢測胎兒染色體非整倍[21-三體綜合征(21 trisomy syndrome，T21)、18-三體綜合征(18 trisomy syndrome，T18)、13-三體綜合征(13 trisomy syndrome，T13)及性染色體數目異常等]異常。自NIPT應用于臨床后，胎兒染色體非整倍體篩查模式發生了改變。從傳統血清學篩查高風險者，高齡者(≥35歲)行產前診斷[1]，到可以選擇NIPT作為高齡孕產婦一線篩查也可作為傳統血清學篩查高風險及臨界風險值樣本的二次篩查。2015年美國婦產科醫師協會(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)和母胎醫學 會 (Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM)推薦所有孕婦都可以選擇NIPT篩查[2-3]。本文回顧性分析解放軍總醫院產前篩查實驗室數據，按照年齡及篩查適應證等條件分組，分別對比陽性預測值、陰性預測值、敏感度、特異性等指標，評估NIPT在臨床應用中的價值。

資料和方法

1 資料 收集2016年1月- 2018年6月于解放軍總醫院進行NIPT篩查的孕婦相關數據，共計8 410例，其中有電話隨訪結局或產前診斷結局的病例7 707例入組，652例失訪及51例NIPT退費無報告數據未入組。7 707例數據按年齡≥35歲和＜35歲分為兩組，≥35歲組2 978例，＜35歲組4 729例。7 707例數據按照篩查適應證進行分類：1)自愿選擇NIPT篩查者4 586例；2)傳統血清學篩查高風險或臨界風險值者2 071例；3)超聲軟指標異常者106例；4)其他(IVF，雙胎，不良孕產史)944例。

2 產前篩查方法 1)傳統血清學篩查：將病人血清分離，采用PerkinElmer公司試劑盒及AUTODELFIA 1235免疫分析儀進行檢測，檢測后數據用Lift cycle4.0軟件進行風險值評估。結果判讀：T21 cut-off值為1∶270，風險值≥1∶270為高風險，臨界風險值為1∶1 000≤風險值＜1∶270。T18 cut-off值為1∶350，風險值≥1∶350為高風險，臨界風險值為1∶1 000≤風險值＜1∶350。神經管畸形高風險為AFP MOM值≥2.5。2)NIPT檢測：采集孕婦外周血5 ml用EDTA抗凝管保存，樣本兩次低溫離心后，在冰盒上將所得血漿轉入新的2.0 ml離心管內，經過DNA提取、測序文庫制備、測序反應、富集、上機等流程后，數據分析得到Z值。結果判讀：初次檢測結果Z值≥4判斷為高風險，需進行產前診斷。Z值≤1.96為低風險，4＞Z＞1.96為臨界風險值需進行重復檢測，重復檢測結果Z值≥3為高風險，Z值＜3為低風險，進入常規孕檢流程。檢測后血漿-80℃儲存2年。

3 產前診斷方法 1)羊水細胞培養及染色體核型分析：將20 ml羊水離心，棄上清，加入羊水培養基混勻后接種，經培養、換液、收獲、低滲、固定、老化、胰酶消化處理、吉姆薩染色后顯微鏡下觀察細胞克隆及染色體形態，進行核型分析。結果判讀：計數10 ～ 15個克隆的染色體數目，分析3個染色體核型，并保存圖像。2)熒光染色體原位雜交檢測(fluorescence in situ hybridization，FISH)：將約10 ml羊水樣本進行離心、低滲、反復固定后根據細胞量加入適量固定液，混勻后滴片經過烤片、探針雜交、細胞膜片洗滌復染等處理，熒光顯微鏡下閱片計數。結果判讀：熒光信號點數代表相應染色體數目，以≥90%的細胞顯示正常熒光信號點數作為未見異常的判斷標準，≥60%異常熒光信號點數作為異常的判斷標準。

4 分析指標 以陽性預測值(positive predictive value，PPV)、陰性預測值 (negative predictive value，NPV)、敏感度(sensitivity)、特異性(specificity)、假陽性率(false positive rate，FPR)、假陰性率(false negative rate，FNR)等指標評估各組NIPT數據。

5 統計分析 采用統計學軟件SPSS25.0進行統計學分析。研究資料主要為計數資料，組間比較用χ2或Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 NIPT高風險篩查在不同年齡組間比較 有隨訪結局或產前診斷結局總例數為7 707例，總高風險76例，見表1。＜35歲組：4 729例，總高風險48例，高風險率為1.02%(48/4 729)。產前診斷確診陽性28例，陽性預測值60.87%，陰性預測值99.96%，敏感度93.33%，特異性99.62%，假陽性率0.383%，假陰性率6.67%。≥35歲組：2 978例，總高風險28例，高風險率為0.94%(28/2 978)，產前診斷確診陽性21例，陽性預測值為75%，陰性預測值100%，敏感度100%，特異性99.76%，假陽性率0.237%，假陰性率0。陽性預測值、陰性預測值，敏感度、特異性在年齡組間大致相近。見表2。

表2 兩年齡組NIPT結果比較Tab. 2 Comparison of NIPT results between the two groups

2 NIPT篩查不同適應證組各指標比較 不同NIPT篩查適應證組間各指標比較，超聲軟指標組各項數據最佳，而自愿選擇組及其他原因選擇NIPT篩查組各出現1例NIPT假陰性結果。見表3。

3 NIPT作為傳統血清學篩查的二次篩查結果2 071例傳統血清學篩查數據中高風險591例，臨界風險值樣本1 480例，選NIPT二次篩查后15例(傳統血清學篩查高風險樣本5例，臨界風險值樣本10例)高風險樣本進行產前診斷。其中10例為真陽性(傳統血清學高風險樣本5例，臨界值樣本5例)，5例為假陽性。見表4。

討 論

T21的發病率為1/800 ～ 1/600，是導致新生兒出生缺陷和死亡的主要疾病[4-6]。因其患兒出生后智力低下且多數生存期較長給家庭及社會帶來沉重負擔，因此T21篩查成為產前篩查的重點對象[7]。本研究中7 707例NIPT篩查樣本中T21高風險26例病例，其中25例為真陽性，1例假陽性，其陽性預測值、陰性預測值、敏感度、特異性高達96.15%、100%、100%、99.99%，假陽性率僅0.013%，假陰性率為0，提示NIPT是目前T21篩查方法中敏感度、特異性最高及假陽性率、假陰性率最低的篩查方法[8]。

表1 7 707例孕婦NIPT診斷結果及診斷性能評價Tab. 1 NIPT results in 7 707 pregnant women and its diagnosis performance

表3 不同篩查適應證檢測效能比較Tab. 3 Comparison of diagnositic performance of NIPT by different screen indication

我國《孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查與診斷技術規范》提出了實驗室二代測序技術質量控制標準：T21、T18、T13的敏感度應分別達到95%、85%、70%。3種目標疾病的復合陽性預測值應不低于50%，復合假陽性率不超過0.5%[9]。本研究中，T21及T13的敏感度都為100%。而3種目標檢測疾病的復合陽性預測值為80%，復合假陽性率為0.104%，達到規范要求。且除了T18敏感度外，對T21、T13篩查均有較高敏感度，與其他文獻相符[3,8]。本研究中T18敏感度為83.33%，是因有1例T18假陰性病例，對其后續檢測(羊水細胞培養及染色體核型分析，FISH，引產后胎盤、胎兒皮膚組織行高通量基因測序檢測)證實此病例為胎盤嵌合導致T18假陰性。見表1。

PPV反映篩查檢測結果為高風險者患目標疾病的可能性。NIPT篩查檢測的PPV與非整倍體發生的流行病學相關，且隨年齡增長而增加[7]。本研究中NIPT篩查結果≥35歲年齡組的PPV和敏感度分別為75%、100%，＜35歲年齡組為60.87%、93.33%，兩年齡組大致相近，見表2。然而有文獻報道40歲年齡組NIPT篩查唐氏綜合征的PPV為87%，而在25歲年齡組為33%[2]，有必要進一步擴大分析樣本量繼續觀察。

NPV表示檢測結果低風險患者中真正未患病的比例。NPV隨流行病學改變，但超過99%的NPV與年齡無關[6,10]。因2例假陰性結果(1例T18，1例胎停流產組織驗證為XXX異常)導致本研究分析結果中＜35歲年齡組NPV低于≥35歲年齡組，見表2。文獻報道NIPT存在技術局限性[11-13]，母體惡性腫瘤、雙胎之一消失或胎盤嵌合等原因可引起假陽性或假陰性結果，胎盤嵌合導致假陰性或假陽性結果較為多見。這是技術方法的局限性，篩查咨詢時應充分告知病人。

NIPT應用于胎兒染色體非整倍體檢測較傳統血清學檢測具有較大優勢，適應證范圍廣，雙胎、高齡、IVF等均可使用[14-16]，也可應用于傳統血清學篩查后的二次篩查[7]。本研究中傳統血清學篩查高風險及風險值在臨界值的樣本共計2 071例，其中血清學篩查高風險591例，而臨界風險值樣本為1 480例，用NIPT二次篩查后，需進行羊膜腔穿刺例數從591例降至15例(傳統血清學篩查高風險5例，臨界風險值10例)，穿刺人數明顯減少，極大程度減輕臨床產前診斷科室的壓力和孕婦不必要的痛苦和緊張。15例羊膜腔穿刺中，確診真陽性結果為10例(傳統血清學篩查高風險樣本5例，臨界風險值樣本5例)見表4，所以可以認為NIPT二次篩查即可以有效降低高風險人群羊膜腔穿刺數，又可以避免傳統血清學篩查臨界風險值人群假陰性結果出現。但Norton等[17]的研究表明，傳統血清學篩查高風險結果經產前診斷確診陽性病例中約83.1%染色體異常NIPT能檢測出來，而約16.9%的染色體異常NIPT檢測不出來，主要為嵌合或稀有染色體異常等。是否可通過增加測序深度和改進算法等技術解決此類問題有待于進一步的研究觀察。

表4 二次NIPT篩查結果陽性的15例病人的檢測結果比較Tab. 4 Agreement between NIPT and prenatal diagnosis in 15 cases with positive results of repeating NIPT screening

超聲軟指標異常主要包括NT增厚、脈絡叢囊腫、心內強回聲等。劉利娜等[18]指出NT增厚特異性較大，而脈絡叢囊腫、心內強回聲等軟指標單獨存在時無明顯特異性。孕早期時檢測NT值，可與早孕期傳統血清學篩查結合使用來提高非整倍體檢出率。NIPT用于臨床后，因其檢測項目不能覆蓋所有非整倍體異常，所以超聲輔助檢查仍然很重要。臨床上，將二者有機結合，也可進一步提高產前篩查效率。本研究數據超聲軟指標異常的106例樣本選擇NIPT篩查后檢出6例真陽性，其PPV、NPV、敏感度、特異性均達到100%，假陽性率和假陰性率為0(表3)，說明超聲軟指標異常者可以選擇NIPT檢測，有助于提高非整倍體異常篩查的敏感度，預防漏診，且產前篩查是需要多種技術檢測結果綜合評估的。

2016年頒布的《國家衛生計生委辦公廳關于規范有序開展孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查及診斷工作的通知》中對NIPT檢測失敗的要求為＜5%[19]。本研究總數8 410例NIPT篩查結果中初次篩查因臨界風險值、GC點偏離、無下機數據、胎兒濃度低等原因未發報告者406例，占總數的4.83%(406/8 410)，符合要求。但是，在臨床工作中，為了降低假陽性率，避免假陰性，對失敗樣本進行重復檢測或重采樣檢測，成功發報告者355例；因多次檢測無法發報告，或者孕婦孕周大沒有進行二次檢測直接退費者51例，實際最終檢測失敗率為0.61%(51/8 410)，有隨訪結局41例均未見異常。雖然臨床實驗室中對于二次重復檢測存在一定爭議，但從本研究數據來看，重復檢測是有必要的。

綜上所述，NIPT是現有胎兒染色體非整倍體篩查技術的最佳選擇，但要求各項指標均達到國家規定質控要求，需要臨床醫生嚴格把控篩查適應證及禁忌證。盡管醫務人員在各環節都有嚴格的質量控制，但NIPT結果仍然存在假陰性及假陽性結果，這是其技術的局限性，應充分告知患者，以避免醫患矛盾。