單寧酶固液發酵對比試驗

劉會 周瑞琪 金偉

摘要 ? ?通過對比單寧酶的液體發酵和固體發酵發現，固體發酵方式潛力較大、成本低、產率高，且充分利用了農林業廢棄物資源，有利于環境和能源的可持續發展。

關鍵詞 ? ?單寧酶;固體發酵;液體發酵;農林廢棄物

中圖分類號 ? ?TQ925 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）15-0228-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?By comparing the liquid fermentation and solid fermentation of tanninase， it was found that solid fermentation had great potential， low cost and high yield， and made full use of agricultural and forestry waste resources， which was conducive to the sustainable development of the environment and energy.

Key words ? ?tannase; solid fermentation; liquid fermentation; agricultural and forestry waste

單寧酶可用于處理茶飲料“冷后渾”、啤酒沉淀、果汁果酒變質等問題，廣泛應用于食品、飲料、制革、化妝、醫藥等行業[1-2]，近年來還用于醫藥中間體——沒食子酸和相關精細化學品的制備[3-4]。

單寧酶的發酵生產有液體發酵和固體發酵2種方式。液體發酵是傳統的微生物發酵方法，具有均一性好、工藝易控制等優點;固體發酵也有其特有的優勢，比如培養基成本低、設備和技術較簡單、能耗低等。本文對2種發酵生產單寧酶的工藝進行全面的比較，以期為現代發酵工藝研究提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

供試菌株：黑曲霉TmF3，由中科院強磁場與離子束物理生物學重點實驗室誘變獲得。

產孢培養基：PDA培養基。

種子培養基：葡萄糖12 g/L，CaCO3 10 g/L，用改良Mandels營養鹽液配制[5]。

液體發酵培養基：秈米粉25 g/L，單寧酸10 g/L，CaCO3 2.5 g/L，（NH4）2SO4 5.0 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 0.15 g/L。

固體發酵培養基：250 mL三角瓶中加入稻殼4.4 g、麩皮0.5 g和五倍子粉1.0 g，液固比2∶1，營養鹽溶液組成為（NH4）2SO4 21 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaCl 1.0 g/L。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?孢子懸浮液配制。從產孢培養基上刮取黑曲霉孢子制成孢子懸液。

1.2.2 ? ?液體發酵。取1 mL孢子懸液（約含5.3×107個孢子）接種于含40 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培養12 h。取2 mL種子液接種于含50 mL液體發酵培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min培養80 h。發酵完成后，濾紙過濾分離發酵液和菌絲體。菌絲體用蒸餾水過濾清洗至無水溶性雜質殘留。稱取部分濕菌體，按40∶1的比例加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH值5.0），對菌絲體進行超聲破碎，超聲條件為：功率600 W，工作時間1 s，間隙時間2 s，工作總時間9 min。破碎完成后用濾紙過濾，留取過濾液。發酵液用透過分子量為8 000～14 000的透析膜在4 ℃條件下過夜透析，以除去沒食子酸。再稱取部分濕菌體，于110 ℃烘箱內烘干至恒重，即得干菌體，稱重。

1.2.3 ? ?固體發酵。每個250 mL三角瓶接種1 mL孢子懸浮液（約5.3×107個孢子），攪拌均勻，30 ℃靜置發酵4 d。發酵完成后，按10∶1比例加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH值5.0），攪拌均勻，180 r/min振蕩浸提1 h，提出粗酶液。

1.2.4 ? ?單寧酶活力測定。測定方法采用比色法[6]。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?發酵培養基成分比較

250 mL三角瓶發酵中，固體發酵培養基包含6.17 g固體成分，固態發酵培養基成分大多為天然原料，如稻殼、麩皮為農產品加工廢棄物，五倍子粉由林產品粗加工制得，這些天然原料不僅價格便宜且營養成分豐富，不需額外添加微量元素，只需添加少量的大量元素和無機氮源。

液體發酵培養基包含2.21 g固體成分，明顯低于固體發酵培養基，但其除了秈米粉為天然原料外，其余成分均為化學試劑，加上種子培養基成分共有13種之多，成分復雜、價格高。另外，液體發酵培養基用水量是固體發酵培養基的4倍多。因此，若用于大規模工業生產，固體發酵成本將遠低于液體發酵。

2.2 ? ?發酵過程比較

液體發酵生產單寧酶需要進行包括種子培養在內的二級發酵，培養過程較復雜，對發酵控制系統的精度要求很高，而且要求環境和發酵容器有較高的潔凈度。另外，誘導物單寧酸對黑曲霉菌體的生長抑制作用十分明顯，其含量最高只占培養基組分的2%。

固體發酵則直接孢子接種，無須種子發酵，且為靜置培養，發酵過程較為簡單。另外，可能由于固體發酵方式更接近于微生物的自然生長環境，黑曲霉在固體發酵中生長更旺盛，對環境中不良因子的耐受力更強，比如更抗雜菌污染，對單寧酸耐受可高達15%等。

2.3 ? ?單寧酶提取工藝比較

液體發酵生產的單寧酶，包括胞內和胞外2個部分，因而菌體和發酵液都需要進行提取，而且菌體還需要進行破碎，才能釋放胞內的單寧酶;而固體發酵生產的單寧酶幾乎全部在胞外，胞內幾乎沒有。因此，若用固體發酵生產單寧酶，其提純工序會更簡單、效率更高、成本也會降低;而且有報道稱，胞外單寧酶與胞內單寧酶的結構不同，固體發酵生產的單寧酶結構均一性要優于液體發酵。

2.4 ? ?固液體發酵單寧酶總活力比較

液體發酵結束后，250 mL三角瓶內干菌體含量約為1.18 g，發酵液約為38 mL，胞內單寧酶活力為44 U/g、胞外約為1.56 U/mL，每個搖瓶生產的單寧酶總活力為111.2 U;固體發酵完成后，每克固體基質產生的單寧酶活力平均為115 U，每個搖瓶生產的單寧酶總活力為709.5 U（是液體發酵的6.38倍）。根據2種發酵方式中每個三角瓶所含的干物質量，可計算出每克干物質固體發酵生產單寧酶的效率是液體發酵的2.3倍。

3 ? ?結論與討論

通過單寧酶液體發酵和固體發酵的對比研究發現，固體發酵方法能顯著提高胞外單寧酶的產量，且生產成本遠低于液體發酵。綜合比較2種發酵方式所用培養基、發酵過程、酶的提取方法和酶總活力等可發現，黑曲霉固體發酵生產單寧酶潛力較大，而液體發酵胞內單寧酶豐富，可以根據實際需要采取不同的發酵方式。此外，固體發酵充分利用了人類生產生活中產生的大量農林業廢棄物，有利于環境和能源的可持續發展。

4 ? ?參考文獻

[1] 保玉心，黃永光，李盛，等.單寧酶的性質與應用研究進展[J].釀酒，2007，34（5）：53-57.

[2] 李夢迪.黑曲霉單寧酶TahA在茶飲料品質提升中的作用[D].天津：天津科技大學，2018.

[3] 錢高青，杜冰心，汪竹群，等.微生物單寧酶及其生物技術進展[J].農產品加工，2018（22）：61-64.

[4] 楊順楷，楊亞力.酶法轉化五倍子單寧酸生產沒食子酸[J].精細與專用化學品，2005，13（5）：12-13.

[5] 吳克，蔡敬民，劉斌，等.黑曲霉A3木聚糖酶酶學性質研究[J].菌物學報，2000，19（3）：383-388.

[6] 金偉，聶光軍，王麗，等.黑曲霉固態發酵生產單寧酶的條件優化[J].生物加工過程，2013，11（3）：7-12.