雁北嗜藍孢孔菌菌株液體培養條件優化

郭霄飛 李艷婷 郭 尚* 宋敏麗 白 倩 徐莉娜 南曉潔 張 程

雁北嗜藍孢孔菌菌株液體培養條件優化

郭霄飛1李艷婷1郭 尚1*宋敏麗2白 倩3徐莉娜1南曉潔1張 程1

（1. 山西省農業科學院食用菌研究所，山西 太原 030031；2. 太原師范學院生物系，山西 晉中 030619；3. 北京理工大學生命學院，北京 100081）

以菌絲體生物量、菌絲生長速度和菌絲體胞外多糖含量為指標，對3個雁北嗜藍孢孔菌菌株液體發酵培養的碳源、氮源和無機鹽進行優化篩選，以為該菌的大規模培養和人工馴化提供依據。結果顯示，海藻糖是1號和2號菌株的最佳碳源，葡萄糖是3號菌株的最佳碳源；3個菌株的最佳氮源均為豆粕粉；最佳無機鹽1號菌株是硫酸鎂，2號、3號菌株是磷酸二氫鉀。

雁北嗜藍孢孔菌；液體發酵；碳源；氮源；無機鹽

雁北嗜藍孢孔菌（S. Guo&L. Zhou）屬于擔子菌門、傘菌綱、銹革孔菌目、銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）、嗜藍孢孔菌屬（），是由郭尚工作室從山西大同地區的沙棘腐木上首次采集得到[1]。該地屬于溫帶大陸性季風氣候，樹木很多，土壤為堿性，有大量的沙棘樹、楊樹林和松樹林[2-5]，當地人將其作為一種治療感冒、提升免疫力的特效藥而經年使用。雁北嗜藍孢孔菌子實體除蛋白、粗多糖、氨基酸等含量較高外，還富含三萜類、多酚、黃酮以及甾醇類等多種益于人體健康的功能性成分[6]。

雁北嗜藍孢孔菌的生長周期較長[3]，目前已初步明確其生長條件[12-15]，但尚無法進行高產培養，以利用其價值。我們分別從山西大同地區的山坡上、水溝邊和平地的沙棘木上分離得到3個雁北嗜藍孢孔菌菌株，采用液體發酵培養方式，以菌絲體生物量、胞外多糖含量、菌絲生長速度作為測定指標，對其營養源進行單因素實驗研究，以探索該菌的最佳發酵配方，為后續利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試菌株。3個雁北嗜藍孢孔菌菌株，分別編號為1、2和3，由山西省農業科學院食用菌研究所保藏。子實體形態見圖1。

圖1 雁北嗜藍孢孔菌子實體形態

（2）試劑。海藻糖、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、豆粕粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、玉米漿、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、氯化鈉、維生素B1、維生素B2、無水乙醇、濃硫酸、苯酚等。

（3）儀器與設備。SM830立式壓力蒸汽滅菌鍋、MS104TS電子分析天平、CRY100B恒溫搖床、BPG-9106A電熱鼓風干燥箱、QXZ-1000A光照恒溫培養箱、SW-CJ-2D超凈工作臺、C21-SDHCB9E88電磁爐、TU-1810PC紫外可見光度計、FC-5706離心機、DZKW-0-2電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 培養基配方單因素試驗

（1）加富PDA培養基。馬鈴薯200 g、磷酸二氫鉀1 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、維生素B110 mg、水1 L。

（2）液體培養基配方。試驗設培養基基礎配方：葡萄糖20 g、蛋白胨35 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.25 g、維生素B1100 μg、維生素B2500 μg、水1 L。

①碳源試驗設5種碳源，分別為葡萄糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉和乳糖。葡萄糖配方為基礎配方，分別將相同重量的其余碳源替換基礎配方中的葡萄糖即為其余碳源的對應配方。

②氮源試驗設5種氮源，分別為蛋白胨、豆粕、尿素、硫酸銨和玉米漿。蛋白胨配方為基礎配方，分別將相同重量的其他氮源替換基礎配方中的蛋白胨即為其余氮源的對應配方。

③無機鹽試驗設5種無機鹽，分別為磷酸二氫鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、碳酸鈉和氯化鈉。磷酸二氫鉀配方為基礎配方，分別將相同重量的其他4種無機鹽替換基礎配方中的磷酸二氫鉀即為其余無機鹽的對應配方。

稱量藥品制備液體培養基溶液置于三角錐形瓶中，于115 ℃下滅菌30 min。將3個菌株分別接種到無菌培養皿中，待菌絲長滿后用打孔器在超凈臺取菌絲接種到裝有不同配方液體發酵液的150 mL培養瓶中，每個菌株各配方設置3個重復。置于25 ℃、轉速150 r/min的恒溫搖床中培養14天后，進行數據測量，探索雁北嗜藍孢孔菌液體發酵的最佳碳、氮源和無機鹽。

1.3 指標鑒定方法

（1）菌絲體生物量測定。將培養14天后的雁北嗜藍孢孔菌發酵液用玻璃棒混勻，在濾紙上過濾后，于60 ℃干燥箱中烘干后取出測量菌球生物量并記錄[16]。

（2）菌絲生長速度測定。從發酵液中隨機挑取肉眼可見的3個菌球，放在無菌平板上培養3天后，取出觀察菌絲生長狀況，用尺子測量菌落直徑，取平均值計算菌絲的日生長速度[7]。

（3）胞外多糖含量測定。采用苯酚-硫酸法。

①配制多糖溶液：將菌球烘干，在研缽內研磨成粉，按料液比為1/50溶解在錐形瓶中，浸泡30 min，置于80 ℃水浴鍋中提取2 h，用玻璃棒不時攪拌。取出自然冷卻至室溫，3 000 r/min離心2次，向離心后溶液中加入4 ℃下預冷的無水乙醇，配制成濃度為80%左右的乙醇液，置于4 ℃冰箱中冷藏，醇沉過夜，使沉淀析出。之后取出離心，取濾液烘干，加5 mL水配成多糖水溶液。

②制備5%的苯酚溶液：在容量瓶中定容，避光保存，現用現配。

③制備標準葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）。

④制備標準曲線：分別量取葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6和0.8 mL置于5支試管中，加蒸餾水使溶液至2 mL，再加1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，靜置30 min；測吸光度，波長為490 nm，空白對照用蒸餾水。用吸光度作為縱坐標，葡萄糖含量作為橫坐標制標準曲線，得到一個回歸方程。

⑤樣品測定：取1 mL多糖溶液，稀釋至2 mL，加入1 mL苯酚和5 mL濃硫酸，靜置30 min，測吸光度，波長為490nm，空白對照用蒸餾水。根據吸光度求得多糖含量[8-11]。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

試驗得到的葡萄糖標準曲線函數為=20.19+0.080 6，2=0.996（圖2）。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.2 不同菌株對碳源的利用

3個雁北嗜藍孢孔菌菌株在5種不同碳源液體培養基上的生長情況不一致（表1），其中1號、2號菌株均在以海藻糖為碳源的培養基中菌絲生長速度較快，菌絲生物量和胞外多糖含量也高；其次是可溶性淀粉和葡萄糖，但與海藻糖的差異不顯著；而乳糖3項指標均極顯著低于其他處理。3號菌株的3項指標則以葡萄糖的較高；海藻糖次之。

表1 3個菌株在不同碳源液體培養基中的發酵狀況

注：各菌株同列不同大、小寫字母分別表示1%和5%水平差異顯著。下同。

2.3 不同菌株對氮源的利用

3個菌株在5種氮源液體培養基中的生長情況不一（表2），但菌絲生長速度、菌絲生物量、胞外多糖含量均以豆粕粉為高。3個菌株在尿素和硫酸銨液體培養基上的生長情況都不佳。

2.4 不同菌株對無機鹽的利用

由表3可知，5種無機鹽液體培養基配方中，1號菌株在磷酸二氫鉀和硫酸鎂培養基的生長狀態差異不顯著，以硫酸鎂培養基的3項指標略高。而2號、3號菌株在磷酸二氫鉀和硫酸鎂培養基的3項指標差異都不顯著，以磷酸二氫鉀培養基略高。3個菌株在碳酸鈉、氯化鈉培養基的生長狀況均不佳。總的來看，1號菌株的最適無機鹽是硫酸鎂，2號和3號菌株的最適無機鹽是磷酸二氫鉀。

3 結論與討論

本試驗從碳源、氮源和無機鹽3方面的營養成分，對3個雁北嗜藍孢孔菌菌株液體發酵的菌球生長狀況進行測定，初步找出不同菌株的最適碳源、氮源和無機鹽，可為該菌的菌種制備及大規模液體發酵利用等提供依據。

1號、2號菌株篩選出的最適碳源為海藻糖，與劉曉鋼等[1]的研究結果一致；3號菌株的最適碳源為葡萄糖。

本試驗3個菌株最適氮源都是豆粕粉，與劉曉鋼等[1]的研究也一致。

篩選出的最適無機鹽，1號菌株為硫酸鎂，2號、3號菌株為磷酸二氫鉀。篩選出最適合的無機鹽為硫酸鎂和磷酸二氫鉀兩種，與趙媛等[7]的研究結果基本一致。

本試驗菌株1號和2號采自山坡和水溝邊，3號菌株從平地采集。實驗結果中不同菌株最適合的碳源和無機鹽有差異。且不同菌株在配方中碳源、氮源、無機鹽相同的情況下，其生物量、菌絲生長速度和胞外多糖含量不同，這可能與菌株采集地的環境有關，具體環境因素有待進一步探索。

表2 3個菌株在不同氮源液體培養基中的發酵狀況

表3 3個菌株在不同無機鹽液體培養基中的發酵狀況

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Optimization of liquid culture conditions of different strains of

Guo Xiaofei1Li Yanting1Guo Shang1*Song Minli2Bai Qian3Xu Lina1Nan Xiaojie1Zhang Cheng1

(1. Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Institute of Edible Fungi, Taiyuan, Shanxi 030031, China; 2. Department of Biology in Taiyuan Normal University, Jinzhong, Shanxi 030619, China; 3. School of Life Science, Beijing institute of technology, Beijing 100081, China)

The mycelium biomass, mycelial activity and extracellular polysaccharide content were used as indicators to study the liquid culture medium ofcollected from three regions, and the best carbon source, nitrogen source and inorganic salt for liquid culture of different strains were screened. The results showed that trehalose was the best carbon source for strain 1 and 2, glucose was the best carbon source for strains 3; the best nitrogen source for all strains was soybean meal; the best inorganic salt for strains 1 was MgSO4, and the best inorganic salt for strains 2 and 3 was KH2PO4. This study can provide the basis for large-scale culture and artificial domestication of this strain.

; liquid culture; carbon source; nitrogen sources; inorganic salts

S646

B

2095-0934（2020）04-272-05

山西省科技基礎條件平臺項目（201705D121012），項目名稱為山西省食用菌種質資源共享服務平臺建設；山西省農業科學院生物育種工程項目（17yzgc115），項目名稱為功能性多孔菌優良菌株的篩選；山西省重點研發計劃項目（201803D221009-2），項目名稱為特色食藥用菌功能產品制造關鍵技術研究與新產品創制

郭霄飛（1985—），男，碩士，助理研究員，主要從事食（藥）用菌資源與綜合利用的研究。E-mail：527305917@qq.com。

郭尚，E-mail：gs0351@sohu.com。