一例豬繁殖與呼吸綜合征病毒和蓋塔病毒混合感染的診斷

次 仁，江朝源，朱 玲，3，徐志文，3

（1.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；2.林芝市農業農村局，西藏 林芝 850400；3.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130）

蓋塔病毒（Getah virus,GETV）是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒屬（Alphavirus）成員[1]。1995 年Scherer等首次在馬來西亞橡膠林中生存的白雪庫蚊（Culex gelidus）中分離得到該病毒[2]。GETV可感染多種動物并引起馬和豬發病。2017年湖南省暴發GETV豬群感染導致大量母豬流產和仔豬死亡，同年10月周峰等首次報道中國河南省某豬場的豬感染蓋塔病毒[3]，這種病毒對10日齡內仔豬有致病性，其癥狀表現為引起仔豬發燒、蕁麻樣皮疹和后肢水腫并伴有關節炎，嚴重時導致死亡，同時也會造成成年母豬繁殖障礙[1]。

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的以造成成年母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸困難為主要特征的傳染病，各種品種和年齡的豬均可感染，但以妊娠母豬和1月齡的仔豬最易感，在臨床上難以對兩種病毒進行區分[4]。

本研究對中國四川省綿陽某豬場送檢的流產胎兒和病死仔豬利用PCR和RT-PCR方法進行豬病毒性疫病的病原檢測，診斷結果表明該例患病豬為豬蓋塔病毒（GETV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的混合感染。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2018年7月在四川農業大學動物生物技術中心進行。

1.2 材料

1.2.1 病料 病料來源于四川省綿陽某豬場送檢的流產胎兒和病豬。

1.2.2 主要設備和試劑 RNAiso Plus來自寶日醫生物技術（北京）有限公司；DL 2 000 DNA Marker、反轉錄酶試劑盒、2×Taq PCR Master-Mix、Nuceanse-Free water和pMD19-Tsimple載體，來自大連寶生物工程有限公司；Trizol LSReagent、小量質粒DNA提取試劑盒和小量膠回收試劑盒，于北京博邁德生物技術有限公司購買。大腸桿菌DH5α由四川農業大學動物生物技術中心制備。PCR儀、Gel DocTMEZ imager凝膠成像系統購自Bio-Rad公司，恒溫水浴鍋、恒溫搖床購自Thermo Fisher公司。

1.2.3 檢測引物的設計與合成 參考GenBank上GETV M1株全基因[7]（登錄號為：EU015061），利用Primer Premiers 5.0軟件針對Cap部分序列設計1對特異性引物[由生物工程（上海）公司合成]，藍耳病采用實驗室建立的高藍和NADC30雙重RT-PCR檢測引物進行檢測，具體信息見表1。

表1 試驗中使用的引物信息

1.3 方法

1.3.1 病料樣品處理 無菌采取送檢病料的肺、大腸共約10 g，用PBS按1∶5稀釋，研磨后反復凍融3次，保存到-20℃。

1.3.2 RNA提取 取300 μL研磨凍融后的病料液按照Trizol RNA提取試劑盒說明書提取病毒總RNA。反轉錄體系（10 μL）：ddH2O 4.5 μL、5×Buffer 2.0 μL、反轉錄酶 0.5 μL、dNTP 0.5 μL、隨機引物0.5 μL、模板 2.0 μL。反應條件為：35 ℃ 5 s、85 ℃15 min，cDNA模板用于PCR擴增。

1.3.3 RT-PCR檢測 PCR 體系（10 μL）：2×TaqPCR master Mix 5.0 μL、cDNA 1.0 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物0.5 μL、ddH2O 3.0 μL。反應擴增條件：95 ℃預變性5 min；95℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表1），72℃延伸 30 s，共35個循環，72 ℃延伸7min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳并進行凝膠成像觀察。1.3.4 流行特點和病理解剖變化 詢問法了解豬場發病情況，常規剖解進行大體觀察。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR診斷

電泳結果顯示送檢病料同時出現PRRSV 333 bp、GETV 316 bp左右的特異性條帶，其余病原均呈陰性結果。由此說明該樣品中同時含有PRRSV、GETV（圖 1）。

2.2 流行特點及臨床癥狀

四川省綿陽市某豬場共有妊娠母豬120頭，仔豬約400頭，送檢流產胎兒為懷孕前、中、后期均有。患病仔豬初時出現采食量下降、被毛粗亂、皮膚蒼白、精神沉郁等癥狀，懷孕母豬大量流產。隨后豬只體溫升高達40～41℃，食欲減少，咳嗽，急喘，耳朵及腹部下皮膚發紺，漸進性消瘦，最后呼吸困難，衰竭而死。

2.3 剖檢病變

隨機抽取1頭發病活豬和1頭病死仔豬進行剖檢，剖檢病變主要為肺呈橡皮樣，肺臟出血且肺間質增寬，腹股溝淋巴結腫大出血，腎臟出現白色壞色斑，腸系膜淋巴結腫大，其他臟器無明顯病變。

3 討論

根據臨床癥狀、剖檢病變，結合實驗室檢測等綜合判定，本次豬場發病豬主要是由藍耳病病毒（NADC30株）和豬蓋塔病毒引起的混合感染。

PRRSV作為能夠引起呼吸和繁殖方面疾病的病毒，可通過呼吸道傳播，豬的規模化養殖模式為PRRSV大規模暴發提供了潛在條件，疾病一旦暴發，傳播迅速，導致大量仔豬死亡，會造成嚴重的經濟損失。GETV屬于人畜共患病病毒，近兩年來中國開始報道分離到豬源的GETV，周峰等[3]于2017年報道分離到該病毒，并在山西、湖北、河南、安徽四省豬場中檢測出37份陽性樣本，同時在2017年湖南省豬群中發生了大規模GETV的感染，大量仔豬死亡，母豬流產導致了重大經濟損失[5]，于2018年分離到第1株四川省豬源蓋塔病毒[6]。兩種病毒均能導致母豬流產，在臨床上僅通過癥狀難以區分兩種病毒，同時近年來病豬混合感染的比例不斷攀升，其中PRRSV和PCV均屬于免疫缺陷病，袁婧等在報道中指出，這兩種免疫缺陷病與多種病原混合感染的現象十分普遍[7]，給疾病的防治工作帶來了困難，多重PCR技術具有快速診斷、敏感度高的特點，將會在動物疫病的監控、診斷、防疫等方面發揮作用。

GETV作為新出現在人們視野中導致母豬流產的病毒，其與各個病原混合感染之間的機制尚不清楚，但在臨床研究中開展流行病學調查和建立混合感染檢測方法，并分析其流行病學特征十分有必要。