規模化種豬場幾種病毒性疫病抗體水平及病原檢測分析

藺俐仲，徐春志，張 海，景書灝，楊 源，劉 艷，劉 霞，李照偉

（1.貴陽市草地站，貴州 貴陽 550081；2.貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550081；3.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550081）

FMD（豬口蹄疫）、CSF（豬瘟）、PRRS（豬繁殖與呼吸綜合征）和PR（豬偽狂犬?。┦且幠；B豬場最常見的幾種主要病毒性疫病[1]，也是當前我國開展“規?；N豬場主要動物疫病凈化創建場”和“規模化種豬場主要動物疫病凈化示范場”評估認證工作中必檢的疫病。其中，FMD是嚴重危害偶蹄動物的傳染病，主要引起畜體口腔黏膜、舌面、唇、鼻鏡、乳頭及蹄叉等部位形成或發生水皰，嚴重者可致死亡，嚴重影響畜牧業的健康持續發展，并造成巨大經濟損失，甚至還會帶來國際政治影響，素有“政治經濟病”之稱[2]，使家畜及其產品的國際貿易受阻[3]。CSF、PRRS和PR是豬群常見的繁殖障礙性疫病，可導致妊娠母豬流產，產死胎、木乃伊胎、病弱胎或畸形胎，嚴重危害畜牧業的發展[4]。因此，做好上述幾種病毒性疫病的檢測評估與凈化對養豬場十分必要[5]。為了掌握某種豬場FMD、CSF、PRRS和PR的免疫抗體水平以及野毒感染情況，以加快貴陽市規?；B豬場主要動物疫病凈化工作步伐，課題組于2019年6—9月對某種豬場開展了豬群健康狀態監測評估，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清和組織樣本 2019年6—8月采集貴陽市某規模化種豬場血清和扁桃體組織樣本各362份，其中生產公豬12份，后備母豬166份，經產母豬184份。經調查，所采集豬只于2019年4—5月期間分別免疫過豬口蹄疫O型滅活疫苗（新疆天康）、高致病性豬藍耳病弱毒疫苗（新疆天康）、豬瘟傳代細胞苗（哈藥集團）和豬偽狂犬病活疫苗（武漢科前）。具體免疫程序如下：FMD（每4個月免疫1次），CSF（種公豬每年春、秋季各免疫1次；種母豬配種前10 d免疫1次，產后10 d加強免疫1次，以后每次免疫應于產后進行，妊娠期不再免疫），PRRS（種公豬每年春、秋季各免疫1次；后備種豬配種前5～6周和2～3周各免疫1次；生產母豬配種前12 d免疫1次，以后每5個月免疫1次）和PR（種公豬每年春、秋季各免疫1次；后備種豬配種前7 d免疫1次，以后每隔4個月免疫1次）。

1.1.2 檢測試劑盒 豬O型口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒gB蛋白和豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限公司；豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC-ELISA抗體檢測試劑盒購自深圳市康百得生物科技有限公司；口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，豬瘟病毒野毒株實時熒光RT-PCR檢測試劑盒和豬偽狂犬病病毒（gE基因）實時熒光PCR檢測試劑盒均購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血清抗體檢測 采集的血清樣本按照標記順序嚴格按上述6種ELISA抗體檢測試劑盒操作說明分別進行FMD、CSF、PRRS、PR的抗體水平檢測和結果判定。

1.2.2 實時熒光PCR/RT-PCR檢測 取采集的扁桃體組織樣本置于滅菌的1.5 mL離心管中，按3～5倍體積加入0.9%的生理鹽水后采用手持式研磨器研磨勻漿，反復凍融3次后12 000 r/min高速離心，取上清液作為備檢樣本。按照上述病毒核酸提取試劑盒操作說明對備檢樣本進行病毒核酸提取，并按上述實時熒光PCR/RT-PCR擴增試劑盒操作說明分別進行體系構建和目的基因擴增，擴增結束后觀察擴增曲線和CT值對結果進行判定。

2 結果

2.1 FMD、CSF、PRRS和PR免疫抗體檢測結果

362 份豬血清經豬O型口蹄疫病毒（FMDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）gB蛋白ELISA抗體檢測試劑盒檢測，結果見表1。

表1檢測結果顯示，豬群FMD、CSF、PRRS和PR的抗體陽性率依次為90.61%、94.75%、88.12%和96.96%。由于該種豬場已免疫過FMD、CSF、PRRS和PR疫苗，且臨床上未觀察到上述4種疫病的癥狀，豬群臨床健康狀況良好，檢測結果表明4種疫病的整體抗體陽性率較高，均超過了國家規定標準70%，說明該場的疫苗免疫效果較好。

表1 免疫抗體檢測結果

2.2 FMD和PR感染抗體檢測結果

362 份豬血清經豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC-ELISA抗體檢測試劑盒和豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒檢測，結果見表2。

表2檢測結果顯示，豬口蹄疫病毒非結構蛋白和豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體陽性率分別為1.38%和3.59%。由于豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC-ELISA抗體檢測試劑盒和豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒檢測的均為野毒感染抗體，檢測結果提示：該種豬場存在FMDV和PRV隱性感染的可能性。

表2 感染抗體檢測結果

2.3 FMDV、CSFV、PRRSV和 PRV實時熒光 PCR/RT-PCR檢測結果

362 份豬扁桃體組織樣本經 FMDV、CSFV、PRRSV和PRV實時熒光PCR/RT-PCR檢測試劑盒檢測，結果見表3。

表3檢測結果顯示，362份豬扁桃體組織樣本經實時熒光PCR/RT-PCR擴增后，FMD、CSF、PRRS和PR的病毒核酸陽性率依次為 0、0.83%、0和1.38%，檢測結果說明被檢樣本中有CSF和PR野毒感染情況。

表3 實時熒光PCR/RT-PCR檢測結果

3 討論

3.1 本試驗采用ELISA和實時熒光PCR/RT-PCR方法對種豬場開展了豬群健康狀態檢測分析，通過檢測分析充分掌握了該豬場FMD、CSF、PRRS和PR的免疫抗體水平和野毒感染情況。試驗結果表明：該豬場4種病毒性疫病的免疫抗體水平較高，說明疫苗免疫效果較好；但FMD和PR的野毒感染抗體檢測結果提示，該豬場存在FMD和PR野毒感染的風險；實時熒光PCR/RT-PCR檢測結果說明，該豬場存在CSF和PR野毒感染情況。針對上述檢測結果分析評估，建議該豬場今后應繼續加強疫苗免疫，并立即對檢出的CSF和PR病毒核酸陽性豬只進行淘汰處理，同時加強對FMD和PR感染抗體陽性豬只的隔離和監控。

3.2 經調查，該豬場免疫的FMD和PR疫苗分別為非結構蛋白3ABC基因和gE蛋白基因缺失苗，課題組為了保證檢測結果的準確性，對FMD、PR的感染情況檢測采用缺失基因ELISA抗體檢測和實時熒光PCR/RT-PCR相結合的方法。檢測結果中PR的野毒感染抗體和實時熒光PCR均出現了陽性，且實時熒光PCR檢出的陽性樣本均顯示野毒感染抗體陽性，進一步說明了該豬場存在PR野毒感染情況；而FMD實時熒光RT-PCR病毒核酸檢出率雖為0，但野毒感染抗體檢測出現了陽性，因此并不能完全排除該場存在FMD野毒感染的可能。經查閱相關資料[6-8]，對FMDV核酸檢測檢出率最高的組織部位為頜下淋巴結，而PRV檢出率最高的組織部位為三叉神經節、嗅球和腦，其次為扁桃體和內臟。本試驗檢測評估的豬場為臨床健康豬群，未能活體采集到頜下淋巴結、三叉神經節和嗅球等組織樣本，只能活體采集扁桃體組織樣本替代，因此不排除實時熒光PCR/RT-PCR出現漏檢的可能。

3.3 FMD、CSF、PRRS和PR是國家開展“規模化種豬場主要動物疫病凈化創建場”和“規?；N豬場主要動物疫病凈化示范場”評估認證指定的4個必檢病種，因此做好種豬場FMD、CSF、PRRS和PR的監測評估工作十分必要。對照“兩場”評估認證標準，本次所監測評估的種豬場豬群健康狀態達到了申報“規?；N豬場主要動物疫病凈化創建場”的要求（種豬群或后備豬群CSF免疫抗體合格率≥80%，FMD免疫抗體合格率≥70%，PR gE抗體陽性率≤10%，PRRS無臨床發病記錄），而要申報“規模化種豬場主要動物疫病凈化示范場”免疫凈化標準尚需對FMD、CSF和PR的野毒感染進行徹底凈化，同時應進一步提高PRRS的免疫抗體合格率至90%以上。