一株豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

胸膜肺炎放線桿菌（Actiuobacillus pleuropueumouiae,APP）可引起豬傳染性胸膜肺炎[1]，各品種和日齡豬均可感染發病，肥育豬和種豬高發。APP血清型眾多，各型間交叉保護力弱[2]，豬場發病后，則很難凈化[3]，且常與其他疾病混合感染發生[4]，給全球的養豬業造成了嚴重的經濟損失[5]。1957年，Pattison首次發現該病[6]。我國1990年正式確認該病存在[7]。近年來，隨著我國規?；B豬業的不斷發展，該病在我國呈多發趨勢。

2019年12月份山東省東營某豬場5月齡豬不明原因突然死亡，送魯北獸醫診斷中心進行檢測。外觀可見病死豬鼻、耳、腿、體側皮膚發紺，口鼻中流出大量血色泡沫分泌物。剖檢可見胸腔有淡紅色積液，氣管、支氣管內有血性泡沫樣分泌物，肺部充血、出血、水腫，呈黑紅色或紫紅色，質地堅實，切開后流出淡紅色泡沫樣液體。懷疑為豬胸膜肺炎放線桿菌感染，無菌采集肺臟進行細菌分離培養、形態學觀察、生化試驗、藥敏試驗、致病性試驗及PCR鑒定，確定此分離株是豬源胸膜肺炎放線桿菌。

1 材料

1.1 病料

對山東省東營某豬場疑似豬傳染性胸膜肺炎病死豬進行剖檢，無菌采取病死豬肺臟作為病料。

1.2 試驗動物

8只15～20 g清潔級昆明系小鼠購自山東省實驗動物中心。

1.3 試劑

草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復紅染液、麥康凱營養瓊脂培養基、0.01%NAD、5%血清的胰酶大豆瓊脂培養基均由山東綠都生物科技有限公司質量監察部提供；藥敏紙片及生化試驗用試劑、糖發酵管等均購自杭州天和微生物試劑有限公司；DL 2 000 Marker、Taq酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；基因組DNA小量抽提試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司。

1.4 PCR引物設計

根據GenBank公布的細菌16S rRNA基因序列，參照文獻[8]設計細菌檢測通用引物，引物序列為F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA-3'；R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC-3'，目的基因片段大小為1 419 bp。引物由通用生物系統（安徽）有限公司有限公司合成。引物用滅菌純化水稀釋成20 nmol/mL，分裝，-20℃保存備用。

2 方法

2.1 直接涂片鏡檢

在無菌條件下，分別將無菌采取病死豬的肺臟涂片或觸片，干燥，固定，革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態特征。

2.2 細菌分離培養

將采集的豬肺臟無菌劃線接種于含0.01%NAD、5%血清的胰酶大豆瓊脂培養基（TSA）中，置燭缸內厭氧培養，37℃培養24 h，觀察生長情況，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢[8]。挑取單個可疑菌落接種于麥康凱營養瓊脂培養基上，37℃培養24 h。

2.3 生化鑒定

分別將分離菌經24 h含0.01%NAD、5%血清TSA平板純培養后，進行糖發酵試驗及其他生化試驗。

2.4 PCR鑒定

取分離細菌純培養物，用基因組DNA小量抽提試劑盒（上海華舜生物技術有限公司）提取核酸作為模板，進行 PCR 擴增。反應體系（20 μL）：10×Buffer（含 MgCl2）2 μL，上下游引物各 1 μL（20 pmol/L）。dNTP 2 μL，rTag 酶 0.2 μL，模板 1 μL，滅菌純化水補至20 μL。擴增反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性 40 s，55℃退火 50 s，72℃延伸 1.5 min，35個循環。取PCR產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物回收，連接到pMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態DH5a，挑取單菌落，搖床培養，將鑒定陽性的質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.5 藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散法（K-B法）將所分離的巴氏桿菌24 h血清肉湯純培養物10倍稀釋后，接種于鮮血瓊脂平板上，每個平板接種0.2 mL，并將其涂布均勻。然后用無菌鑷子將各種藥敏片分別平放在培養基表面，保持紙片間適度距離，37℃溫箱培養24 h。觀察結果并測量抑菌圈直徑。

2.6 致病性試驗

8只小白鼠，隨機分為兩組，即試驗組和對照組，每組4只。試驗組小鼠每只腹腔注射0.2 mL（8×109CFU/mL）分離菌純培養液，對照組每只小鼠腹腔注射生理鹽水0.2 mL。觀察小鼠發病情況，小鼠死亡后，剖檢、記錄病理變化，取無菌采集肺臟，進行細菌分離培養鑒定。

3 結果與分析

3.1 直接涂片鏡檢結果

肺臟觸片革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性球桿菌。

3.2 細菌分離培養結果

在TSA瓊脂平板上37℃培養24 h后，形成表面光滑濕潤、圓形隆起、邊緣整齊、灰白色不透明、針尖大小的菌落。挑取單個菌落涂片進行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性球桿菌。在麥康凱營養瓊脂培養基上未見生長。

3.3 生化試驗結果

由表1可知，從病死豬中分離的胸膜肺炎放線桿菌能發酵蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖，不能發酵乳糖、棉籽糖、山梨醇、海藻糖、阿拉伯糖、甘露醇、衛矛醇，靛基質試驗陰性，VP試驗陰性，硫化氫試驗陰性，MR試驗陰性，與胸膜肺炎放線桿菌生化特征一致。

表1 分離菌的生化反應結果

3.4 PCR鑒定

PCR檢測結果顯示，在1 419 bp處有一特異性條帶，目的基因回收后，連pMD18-T載體，陽性質粒送樣測序，測得序列與GenBank收錄基因序列進行同源性比較，與胸膜肺炎放線桿菌16S rRNA序列同源性為100%，可知分離菌為胸膜肺炎放線桿菌。

3.5 藥物敏感性試驗結果

由表2可知，分離菌對頭孢喹肟、氟苯尼考高度敏感，對恩諾沙星、強力霉素、多黏菌素B、泰妙菌素低度敏感，對四環素、紅霉素、阿莫西林、替米考星、復方新諾明、慶大霉素、丁胺卡那、利高霉素耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結果 mm

3.6 致病性試驗

試驗組小鼠在注射菌液24 h后，精神沉郁，采食量減少，不愛運動。小鼠在24～72 h內全部死亡，剖檢可見肺臟出血，與胸膜有纖維素樣黏連，腸系膜淋巴結發生水腫。無菌取肺臟進行細菌分離培養，革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性球桿菌，與從病死豬體內分離菌形態大小一致。對照組健活。

4 討論

本試驗對山東東營死豬肺臟進行細菌分離，以表型特征為依據初步鑒定為胸膜肺炎放線桿菌，采用常規的鑒定方法如生化試驗、藥敏試驗進行鑒定，并對分離菌進行分子水平的鑒定，表明分離菌為豬胸膜肺炎放線桿菌，PCR方法極大地縮短了從病原上診斷該病的時間，從而為豬胸膜肺炎放線桿菌病的快速診斷提供了有力的工具。胸膜肺炎放線桿菌對營養要求高，很難分離培養，應選擇瀕死期豬或剛死亡豬剖檢，取新鮮肺組織，否則可能會因細菌死亡或雜菌過多而導致細菌分離失敗。細菌分離所選用用培養基一定要新鮮配置，并添加一定濃度的NAD和血清等。生化試驗結果表明，該分離菌生化特征與胸膜肺炎放線桿菌一致，能發酵蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖，不能發酵乳糖、棉籽糖、山梨醇、海藻糖、阿拉伯糖、甘露醇、衛矛醇，靛基質試驗陰性，VP試驗陰性，硫化氫試驗陰性，MR試驗陰性。藥敏試驗結果表明，該分離株對頭孢喹肟、氟苯尼考高度敏感，對恩諾沙星、強力霉素、多黏菌素B、泰妙菌素低度敏感。豬胸膜肺炎放線桿菌非常容易產生耐藥性，豬場發病后最好分離細菌進行藥敏試驗，選取敏感藥物，并進行輪換和穿梭用藥，防止耐藥性產生，提高防控效果。動物致病性試驗表明，可使小白鼠致死，再次分離細菌仍然為胸膜肺炎放線桿菌，說明該分離菌毒力較強。

豬傳染性胸膜肺炎是規模化豬場的一種常發病，發病后損失嚴重，豬場一定要采取措施預防疾病的發生，做好豬場生物安全管理，要做好日常防控定期監測，及時淘汰陽性豬，改善環境，做好消毒工作，加強飼養管理。可接種疫苗預防豬傳染性胸膜肺炎的發生和流行，目前豬傳染性胸膜肺炎有滅活疫苗。因傳染性胸膜肺炎血清型眾多，各血清型間交叉保護力弱，因此，疫苗保護效果不理想。本研究所分離菌株具有一定毒力，為疫苗的進一步研制奠定了基礎。