豬繁殖與呼吸綜合征病毒湘潭分離株GP5基因的遺傳進化分析

周 政

（湘潭市易俗河鎮農技農機畜牧水產推廣服務中心，湖南 湘潭 411228）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS），又稱為“豬藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起的一種具有高度傳染性的疾病[1]。我國于1996年首次在母豬流產胎兒體內分離到該病毒，其后在我國多地區報道該病的發生與流行，但未對我國養豬業造成嚴重的經濟損失[2]。2006年，我國江西地區大面積暴發以急性、高熱、高發病率和死亡率為主要臨床特點的高致病性藍耳病（HP-PRRS），其后疫情在各地區廣泛流行，給養殖行業帶來巨大的經濟損失。

PRRSV基因型可分為美洲型和歐洲型，GP5基因序列是變異率最高的基因之一，分析GP5基因變異情況可基本分析整個病毒基因組序列變異情況。本次研究對湘潭市某疑似感染PRRSV的豬場送檢肺臟樣品進行病原檢測，通過RT-PCR法擴增并測定其GP5基因全序列，及進行遺傳變異分析，旨在初步了解湘潭地區豬PRRSV流行毒株遺傳變異規律，為相應的防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料采集

2018年10月12日，筆者及團隊于湖南湘潭市某養豬場采集2份疑似PRRSV感染的流產母豬的肺臟樣品，病豬出現高熱、呼吸困難和流產等臨床癥狀，并最終死亡。

1.2 主要試劑

DNA/RNA extraction kit購自于美國Axygen公司，反轉錄試劑盒為天根生物公司產品；2×Taq PCR mix、DL 2 000 Marker和 Gel extraction kit等購自于TaKaRa公司；不同規格移液器購自于大龍興創實驗儀器（北京）有限公司。

1.3 引物合成與病毒檢測

參考文獻[3]合成擴增GP5基因序列全長的一對引物用于PRRSV的病原檢測與分析，其擴增片段包括GP5基因序列全長，引物由長沙擎科生物科技有限公司合成。

取適量肺臟病變組織與滅菌PBS混合，高速勻漿后離心（12 000 r/min×10 min），取 200 μL 上清液用于病毒基因組（DNA/RNA）提取，操作流程按照說明書步驟進行。將基因組反轉錄獲得cDNA。PCR反應體系（50 μL）：25 μL 2×Taq PCR mix，上下游引物各 2 μL，cDNA 模板 3 μL，滅菌水 18 μL；反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，37個循環；72℃7 min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將陽性產物切膠后用Gel extraction kit回收DNA，進行雙向測序。

1.4 序列分析與遺傳進化分析

應用Clustal X 2.0軟件對獲得的測序結構進行拼接，下載GenBank收錄的PRRSV參考毒株，利用DNAstar軟件對序列進行比對，分別比較核苷酸和氨基酸序列的變異情況；應用MEGA 7.0軟件中臨接法對本次研究獲得的PRRSV分離株GP5基因序列進行遺傳進化分析。

2 結果

2.1 PRRSV病原檢測結果

以提取的病料RNA所制備的cDNA為模板，應用RT-PCR法對兩份病料中PRRSV病原進行檢測，結果如圖1所示，擴增基因片段全長大小約為1 600 bp，與預期結果一致，兩份被檢樣品均顯示為PRRSV陽性。

2.2 PRRSV GP基因序列同源性分析

利用DNAstar軟件對測序的結果進行整理，并與GenBank收錄的毒株序列進行核苷酸同源性比較，結果顯示：本次研究獲得的兩株PRRSV分離株GP基因序列大小為603 bp，不存在核苷酸缺失或插入，以單個位點突變為主，其核苷酸同源性為99.7%，與HP-PRRSV分離株JXA1、CH-1a和TJ分離株同源性分別為99.0%～99.3%、94.2%～94.5%和99.0%～99.3%；與中國湖南省分離的毒株08HuN和Hunan-1核苷酸同源性較高，為99.0%～99.3%和99.2%～99.5%；與歐洲型 Lelystad virus（LV）分離株同源性為54.1%～54.7%；與美洲型經典疫苗株（MLV）和經典株（VR2332）同源性分別為86.1%～86.6%和86.1%～86.6%。

2.3 PRRSV GP基因序列遺傳進化分析

應用MEGA 7.0軟件繪制本次研究獲得的兩株PRRSV分離株（HuN-HH1和HuN-HH2）與GenBank收錄的16株PRRSV分離株形成的遺傳進化樹，分析其遺傳進化關系，初步確定其所屬亞型。結果顯示，本次研究獲得的2株毒株與JXA1等HPPRRSV分離株聚為同一分支，且與湖南省分離的毒株（08HuN、Hunan-1）屬于同一分支，親緣關系較近；與經典毒株（MLV和VR2332等）和NADC30-Like毒株（NADC30等）所屬分支均相隔較遠，提示本次研究獲得的兩株PRRSV流行毒株均為高毒力毒株。

3 討論

PRRSV在我國于1996年首次分離，其后該病在我國豬群中廣泛流行與傳播，目前PRRS是影響我國養豬業發展的主要傳染病之一。PRRSV屬于RNA病毒，具有毒株多樣性和基因高變異率的特點。2006年，我國首次暴發HP-PRRSV，該病可導致患病豬群大規模死亡，造成相應的經濟損失不可估量，其后我國也報道了DADC30-Like、QYYZ-Like等新發的變異毒株，使得有效防控PRRS發生與流行較為困難[4-5]。2018年7月初，湘潭市某豬場暴發疫病，通過臨床診斷和病理解剖初步判斷為PRRSV感染所引起，同時應用RT-PCR法對發病原因進行確診，即為PRRSV陽性。

GP5基因是PRRSV主要的囊膜蛋白，同時也是具有高變異率的主要基因之一，通過監測GP5基因序列變異情況可大致了解PRRSV毒株變異情況。本次研究通過對兩株PRRSV毒株的GP5基因序列進行擴增、測序與分析，結果顯示，兩株PRRSV毒株的GP5基因序列全長為603 bp，不存在堿基插入或缺失，只出現了單個堿基突變，兩株毒株GP5基因核苷酸序列同源性為99.7%，與JXA1、TJ和08HuN等HP-PRRSV分離株核苷酸同源性為99.0%～99.5%，與美洲型經典疫苗株（MLV）和經典株（VR2332）同源性為 86.1%～86.6%，與歐洲型Lelystad virus（LV）分離株同源性為54.1%～54.7%；進一步遺傳進化分析結果也顯示本次研究的2株PRRSV流行株屬于HP-PRRSV毒株。本次研究為該豬場乃至湘潭市PRRS的防控提供了依據。