規模化豬場仔豬豬鏈球菌分離鑒定及藥物敏感性分析

曾 凱，康潤敏，楊躍奎，陳曉暉，王 言，楊雪梅，康立友，于吉鋒

（1.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066；2.成都市青白江區農業農村局，四川 成都 610300）

豬鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，兼性厭氧性球菌。該菌感染豬后，可以引起豬腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內膜炎和關節炎，給養豬業帶來重大經濟損失[1]。該菌主要存在于健康豬鼻黏膜和扁桃體，當豬機體免疫力下降、受到環境刺激可導致豬群發病[2]。此外，豬鏈球菌常可通過傷口或者胃腸道等途徑感染人，從而可引起人腦膜炎及鏈球菌中毒性休克綜合征等[3]。哺乳仔豬和剛斷奶仔豬常以敗血癥型、腦膜炎型為主，發病率和死亡率均較高；而肥育豬發病多以關節炎或淋巴結膿腫為特征，其死亡率較低，但生長發育顯著減慢。鏈球菌病易與豬瘟、藍耳病等混合感染，單純的豬鏈球菌病較少見，這也是近年來豬群發病后難以控制的原因之一。該病原可分為35種血清型（1～34型及1/2型），血清2型被認為致病力最強，同樣也是發病豬體內時常被分離的血清型菌株，其次為血清9型[4]。近幾年來，國內外出現了多例人感染豬鏈球菌的報告[5-7]，這表明豬鏈球菌對公眾健康和養豬業是一個持續的威脅。

2019年10月，四川省某豬場保育豬突然發病，高熱、呼吸急促、減食、腹下和四肢等處呈現彌散性出血斑點，部分病豬精神不振、畏寒等臨床癥狀，并發生了部分保育豬死亡的情況。因此送檢4頭病死豬，從送檢的病豬心臟中均分離出細菌；經16S rDNA測序擴增證實該菌為豬鏈球菌；經PCR鑒定該豬鏈球菌為血清2型；小鼠感染試驗結果顯示，該菌具有較高的致病性，進一步對該菌進行了藥敏試驗，為豬場對豬鏈球菌感染的防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 病料及試驗動物

病料來自成都市某豬場送檢的病死豬。雌性BALB/c小鼠（20只，SPF級，5周齡）購自四川大學試驗動物中心。

1.2 主要試劑

細菌總DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；2×Taq PCR Mix 購自 DBI公司；DL 2 000 Plus DNA Marker，購自北京索萊寶科技有限公司；TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂）和TSB（胰蛋白胨大豆肉湯）培養基，購自北京奧博星生物技術有限公司；新生牛血清為浙江天杭生物科技股份有限公司產品；藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司產品。

1.3 細菌分離純化

蘸取病料內部，劃線接種含5%小牛血清的TSA平板，37℃培養約18～20 h，挑取單菌落進行革蘭氏染色鏡檢；挑取經鑒定的疑似豬鏈球菌單菌落，接種于添加5%新生牛血清的TSB培養基，37℃培養18～20 h，用于后續試驗。

1.4 細菌種類及血清型鑒定

參考文獻報道的16S rDNA序列設計合成引物16S rDNA引物（表1），以純化細菌的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后送交北京擎科新業生物技術有限公司測序。同時，參考文獻設計豬鏈球菌血清1型、2型、7型和9型的特異性引物（表1），以純化細菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，進一步確定豬鏈球菌血清型。

表1 引物列表

1.5 致病性試驗

取培養的豬鏈球菌菌液，5 000 r/min離心去上清液，采用PBS重懸菌體，并調整重懸菌液濃度到1×109CFU/mL。將BALB/c小鼠隨機分為2組（Ⅰ、Ⅱ），每組10只。Ⅰ組小鼠腹腔注射0.2 mL豬鏈球菌菌懸液；Ⅱ組小鼠腹腔注射20 μL PBS，作為對照組。注射后觀察7 d，每天記錄存活情況。

1.6 藥敏試驗

挑取平板上的單菌落，接種于添加5%新生牛血清的TSB培養基，37℃搖菌過夜。用PBS稀釋菌液到0.5麥氏濁度標準，取200 μL將其均勻涂布于添加5%新生牛血清的TSA平板上。選取21種常用藥物的藥敏紙片，貼于涂布細菌的平板上，每塊平板上貼6個藥敏紙片，37℃過夜培養，取出并測量抑菌圈直徑。參考藥敏紙片說明書判定藥敏結果。

2 結果與分析

2.1 細菌鏡檢

TSA平板（含5%新生牛血清）菌落為圓形、光滑、半透明的小菌落，革蘭氏染色為陽性成對或者短鏈狀（圖1）。

2.2 細菌的血清型

采用PCR擴增16 S引物擴增細菌16 S基因片段（圖2），經北京擎科新業生物技術有限公司測序，序列經NCBI比對確定為豬鏈球菌；采用血清型鑒定引物對鑒定的豬鏈球菌進行分型鑒定，2型引物擴增出大小為450 bp片段，而用其他分型引物未擴增出DNA片段（圖3），因此確定分離菌株為豬鏈球菌2型。

2.3 致病性試驗

用BALB/c小鼠評估了分離菌株的致病性。在注射菌體混懸液后24 h，Ⅰ組有9只小鼠死亡，7 d內存活1只。對照組無小鼠死亡，說明豬場分離的2型豬鏈球菌具有很高的致病性。

2.4 藥物敏感性試驗

分離株的藥物敏感性如表2所示，分離株對10種藥物敏感，對11種藥物表現出耐藥或中介。分離株主要對喹諾酮類（恩諾沙星）和β-內酰胺類（阿莫西林、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢拉定、頭孢克洛）的藥物表現出較強的敏感性，而對氨基糖苷類（卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、阿米卡星）、大環內酯類（紅霉素、阿奇霉素）、四環素類（四環素、強力霉素）、氯霉素類（氟苯尼考）、林可胺類（林可霉素）、磺胺類（磺胺間甲氧嘧啶鈉）均產生了較強的耐藥性。

表2 藥物敏感性試驗

3 討論與結論

豬鏈球菌是豬群自然攜帶的病原菌之一，近年來，隨著中國集約化養豬的發展，豬鏈球菌病呈現出高發的態勢。該研究從四川省某豬場的送檢病死豬中分離出3株細菌，經16S rDNA測序確定為豬鏈球菌，同時采用分型鑒定PCR方法針對分離毒株進行了血清型的鑒定，同時，小鼠的致病性結果表明，該分離毒株具有較強的致病性，據此可推斷該豬場的病原為豬鏈球菌2型。

為了給該場的疫病防控及治療提供參考數據，該研究對分離菌株進行了藥物敏感性方面的研究，結果表明，分離株主要對β-內酰胺類藥物表現出較強的敏感性，而對氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類、氯霉素類、林可胺類、磺胺類均產生了較強的耐藥性。因此該場的豬鏈球菌治療優先選擇喹諾酮類（恩諾沙星）和β-內酰胺類（青霉素類和頭孢類）藥物。