去勢(shì)法構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥模型大鼠肱骨與股骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)比較

劉月姝 江國(guó)健 梁志健

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東佛山 528248）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種系統(tǒng)性骨病，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥以骨量減少，骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少，骨皮質(zhì)多孔、變薄為特征[1]。構(gòu)造實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥模型有多種方法，其中，去勢(shì)法最為常用的方法[2]。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、簡(jiǎn)稱(chēng)骨計(jì)量學(xué)，近年來(lái)被廣泛用于骨質(zhì)疏松等代謝性骨病發(fā)生機(jī)制、藥效學(xué)及各種防治手段的研究[3]。本試驗(yàn)選擇去勢(shì)SD大鼠骨質(zhì)疏松癥模型動(dòng)物，比較肱骨及股骨的組織學(xué)、及骨組織計(jì)量學(xué)是否存在差異，以便在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中選擇最佳部位用以評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松癥模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雌性3月齡SPF級(jí)SD大鼠20只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。動(dòng)物隨機(jī)分為2組，假手術(shù)組、模型組，各組10只動(dòng)物。

1.2 主要試劑

注射用青霉素鈉，華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司，批號(hào)1809 8，石蠟，廣東大川特種蠟有限公司，批號(hào)：20191013，環(huán)保透明劑，武漢宏茲生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2020010602，無(wú)水乙醇，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)，批號(hào)：2019120213，曙紅（醇溶），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190820，蘇木素，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10529154，甲醛溶液，西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)200417 2。

1.3 主要儀器

BS-3000A型電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司，感量：0.1g；ASP300S型生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)，LEICA，德國(guó)；EG1150型生物組織包埋機(jī)，LEICA，德國(guó)；AutoStainer-XL型自動(dòng)染色機(jī)：LEICA?，德國(guó)。BX43型生物顯微鏡：OLYMPUS，日本。CellSens Standard顯微圖像軟件：OLYMPUS，日本。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 去勢(shì)手術(shù)方法

腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，注射體積為1.5ml/kg。俯臥位于手術(shù)板上，背部中下部皮膚備毛，75%乙醇消毒，背部中下部作1～2cm縱行切口，止血鉗伸入切口向兩側(cè)進(jìn)行鈍性分離，使背部皮膚與肌層分離。移動(dòng)切口，使切口位于左右兩側(cè)腹后壁肌肉層較薄處打開(kāi)腹腔，切口盡量小，暴露乳白色條帶狀脂肪團(tuán)，于其中找出淡紅色卵巢。0號(hào)縫合線(xiàn)于卵巢和子宮的連接處結(jié)扎，另結(jié)扎卵巢下方脂肪團(tuán)，避免剪除卵巢時(shí)傷及脂肪團(tuán)里血管，引起出血。結(jié)扎后剪除卵巢，將子宮輕輕置回入腹腔，逐層縫合，碘伏消毒創(chuàng)口。假手術(shù)組動(dòng)物不摘除卵巢，只剪除卵巢周?chē)闹窘M織，大小與卵巢相當(dāng)即可，其余操作同上。術(shù)后動(dòng)物肌肉注射青霉素注射液，8萬(wàn)單位/只，連續(xù)注射3d，以防動(dòng)物術(shù)后感染。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)12周。

1.4.2 組織學(xué)評(píng)價(jià)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，麻醉放血處死動(dòng)物，解剖取出左側(cè)肱骨及股骨，用紗布除去骨干周?chē)街募∪饨M織后用4%中性甲醛固定72h以上。使用Plank-Rychlo脫鈣液脫鈣，脫鈣后的骨組織經(jīng)手捏富彈性、用取材刀的刀鋒輕刮骨髓表面無(wú)沙沙聲時(shí)脫鈣結(jié)束，留取肱骨及股骨近端、取正中矢狀面經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片（厚度3μm）、HE染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察骨組織形態(tài)。

1.4.3 骨組織計(jì)量學(xué)參數(shù)測(cè)定方法

選取骨骺生長(zhǎng)板以下1～3mm范圍的區(qū)域拍攝40×照片，使用顯微圖像軟件測(cè)量骨組織面積（T.Ar）、骨小梁面積（Tb.Ar）以及骨小梁周長(zhǎng)（Tb.Pm），按照計(jì)算公式計(jì)算骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量以及骨小梁分離度。

表1 骨組織計(jì)量參數(shù)計(jì)算公式[4]

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±s）表示，應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)差異顯著，P＜0.01時(shí)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)變化（圖1）

假手術(shù)組動(dòng)物肱骨及股骨結(jié)構(gòu)基本正常，骨皮質(zhì)未見(jiàn)變薄，骨小梁致密，骨髓腔大小正常，高倍視野下，骨小梁周?chē)梢?jiàn)成骨細(xì)胞、偶見(jiàn)或未見(jiàn)破骨細(xì)胞。模型對(duì)照組動(dòng)物肱骨及股骨骨皮質(zhì)變薄、股骨變化更明顯，肱骨及股骨骨小梁變細(xì)、斷裂不連續(xù)、數(shù)量減少、排列稀疏，骨髓腔擴(kuò)大、骨髓脂肪組織增生，高倍視野下，骨小梁周?chē)晒羌?xì)胞減少、易見(jiàn)破骨細(xì)胞。

2.2 骨計(jì)量學(xué)參數(shù)結(jié)果

術(shù)后12周，肱骨及股骨的模型組骨組織計(jì)量學(xué)參數(shù)較假手術(shù)組可見(jiàn)明顯變化：其中，骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量極顯著（P＜0.01）下降，骨小梁分離度極顯著（P＜0.01）升高。肱骨與股骨之間比較：可見(jiàn)假手術(shù)組骨小梁面積百分?jǐn)?shù)存在極顯著（P＜0.01）差異、骨小梁分離度存在顯著（P＜0.05）差異，假手術(shù)骨小梁厚度和骨小梁數(shù)量未見(jiàn)顯著差異（P＞0.05）；模型組骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度存在極顯著（P＜0.01）差異。

圖1 各組大鼠肱骨及股骨組織病理學(xué)變化（-1：HE ×40，-2：HE ×400）

表2 骨計(jì)量學(xué)參數(shù)比較（n=10）

3 討論

臨床上，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病之一。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生是由于骨細(xì)胞活動(dòng)失衡，破骨作用大于成骨作用，致使總骨量降低，從而導(dǎo)致骨骼強(qiáng)度降低，臨床表現(xiàn)為骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，骨骼畸形、嚴(yán)重疼痛，有時(shí)甚至引起死亡[5]。構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型最常用的方法是去勢(shì)法，尤其在雌性動(dòng)物，能夠看到更好的造模效果[6]。這是因?yàn)榇菩詣?dòng)物經(jīng)手術(shù)去勢(shì)，由于體內(nèi)雌激素含量降低、破骨細(xì)胞受到的抑制作用減弱，最終因破骨作用大于成骨作用而使得骨組織微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，骨質(zhì)丟失、骨量減少，出現(xiàn)類(lèi)似于臨床所見(jiàn)的女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一系列變化[7]。

治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，主要包括鈣劑、維生素D、抗消化劑如雌激素、雙膦鹽酸，以及合成類(lèi)固醇，但這些藥物在實(shí)現(xiàn)治療效果的同時(shí)也會(huì)有一系列副作用[8]，因此，尋找更好的藥物以期治療或者預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，成為骨質(zhì)疏松癥研究的熱點(diǎn)。判斷藥效及藥物安全性，首先需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)，而去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型是常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，為了獲得更多指標(biāo)作為判斷依據(jù)、同時(shí)遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的“3R”原則，不少研究者會(huì)選擇同一例動(dòng)物不同部位的骨組織去做不同的指標(biāo)檢測(cè)，選擇的部位通常有肱骨、股骨、脛骨、椎骨等，檢測(cè)的內(nèi)容有骨密度、骨鈣等元素、骨組織學(xué)、骨計(jì)量學(xué)、骨生物力學(xué)等。其中，股骨和肱骨為常選部位、骨松質(zhì)組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)為常測(cè)指標(biāo)[9-19]。

骨計(jì)量學(xué)，屬于體視學(xué)、生物醫(yī)學(xué)組織形態(tài)計(jì)量學(xué)的特殊分支之一，該方法能夠?qū)⑿螒B(tài)學(xué)觀(guān)察到的骨組織結(jié)構(gòu)改變，轉(zhuǎn)化為定量的參數(shù)，從靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩個(gè)方面評(píng)價(jià)骨組織的變化、精確反映骨重建過(guò)程的變化規(guī)律和特點(diǎn)[20]。骨計(jì)量學(xué)參數(shù)中的骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量以及骨小梁分離度屬于骨松質(zhì)組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)，是反映骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及骨量變化的重要指標(biāo)。骨小梁面積百分?jǐn)?shù)反映骨量的多少，用以評(píng)價(jià)骨量變化，骨小梁厚度以及骨小梁數(shù)量都反映骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)、間接反映了骨量的變化，骨小梁分離度反映了骨小梁之間的平均距離、即骨小梁的疏密程度。

本試驗(yàn)中，雌性SD大鼠去勢(shì)手術(shù)后12周，肱骨及股骨的組織學(xué)檢查結(jié)果和骨計(jì)量學(xué)測(cè)定結(jié)果均反映了模型動(dòng)物骨量減少、骨質(zhì)丟失，再次驗(yàn)證了去勢(shì)構(gòu)建SD大鼠骨質(zhì)疏松癥模型方法具有高效、穩(wěn)定的特點(diǎn)。假手術(shù)組，股骨骨小梁面積百分?jǐn)?shù)和骨小梁分離度明顯低于肱骨、存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明股骨骨松質(zhì)骨量、骨松質(zhì)密度可能在造模之前就低于肱骨。造模后，除以上兩個(gè)參數(shù)外、股骨的骨小梁數(shù)量亦明顯低于肱骨、可見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)合組織學(xué)見(jiàn)到的骨小梁變細(xì)、斷裂等變化，可推斷造模后12周，股骨的結(jié)構(gòu)變化更為明顯、骨量丟失更為嚴(yán)重，由此可見(jiàn)不同部位長(zhǎng)骨的骨重建過(guò)程本身存在明顯差異、造模后的變化亦存在明顯差異，這一現(xiàn)象對(duì)藥效試驗(yàn)的結(jié)果判定可能有潛在影響。在同等條件下，變化明顯的部位，更適于評(píng)價(jià)藥效。

綜上所述，本試驗(yàn)證明采用去勢(shì)法構(gòu)建的雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型，在造模后12周，股骨的骨組織計(jì)量參數(shù)變化較肱骨更為明顯，評(píng)價(jià)藥效時(shí)可優(yōu)先選擇股骨作為檢測(cè)骨組織計(jì)量參數(shù)的對(duì)象。