miR-223-5p、BMP4與大鼠脊髓損傷的相關性分析

彭川 胡明亮 李圣杰

【摘 ?要】目的：分析miR-223-5p、BMP4與大鼠脊髓損傷的相關性;方法：選取40只標準大鼠，隨機分為觀察組和對照組，每組各20只。觀察組大鼠采用Allens法制備，對照組僅暴露脊髓。分別觀察兩組大鼠在術后2h、6h和12h的脊髓損傷情況。其中，miR-223-5p進行基因擴列，觀察其轉錄有的TNFR1 和 DR6靶向蛋白，分析兩組大鼠的miR-223-5p、BMP4陽性表達率;結果：觀察組隨著損傷時間的延長，受損脊髓段神經元的水腫、纖維消失程度加劇，且出現出血性的囊腔，且上述指標的嚴重程度明顯高于對照組。同時，兩組大鼠受損脊髓段的TNFR1 、DR和BMP4陽性率顯著上述，觀察組的上述率高于對照組，存在顯著差異（p<0.05）。結論：minR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR和BMP4與大鼠脊髓損傷程度正相關，可以作為SD大鼠脊髓損傷的提示指標。

【關鍵詞】脊髓損傷;靶向蛋白;miR-223-5p;BMP4

【中圖分類號】R651 ? ? ?【文獻標識碼】A ? ? ?【文章編號】1672-3783（2020）08-0045-02

脊髓損傷是受損段出現神經細胞凋亡，不能正確傳輸外界刺激信號。實驗研究顯示：miR-223-5p信號通路是神經信號傳輸的介質[1]，但其與損傷神經間的相關性尚不明確。又有研究顯示，BMP4（transforming growth factor β，TGF-β）參與脊髓損傷后的炎癥反應，是受損組織壞死的反應，但其參與的程度尚不明確。基于上述原因，本文以miR-223-5p和BMP4為研究對象，分析兩者與大鼠脊髓損傷的相關性。

1.材料與方法

1.1材料

選擇40只SD雄性大鼠，隨機分為兩組，每組各20只。兩組大鼠的年齡、體重等方面資料無顯著差異，可以進行統計學分析。

1.2脊髓損傷模型制備

兩組大鼠采用不同的制備方式，觀察組先對大鼠進行1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔麻醉，對其T10棘突位置進行切口，分離周圍肌肉。同時，用直蚊式有齒血管鉗對棘突和兩側椎板進行破壞，充分暴露硬脊膜，并用重物打擊硬膜囊造成脊髓損傷;對照組僅進行脊髓暴露，但不進行重物擊打兩組大鼠制備完成后[2]，進行單籠飼養，人工排尿。

1.3實驗方法和指標

兩組大鼠分別采用和PCR染色檢驗，對比大鼠的脊髓損傷程度，以及神經元水腫和神經纖維消失情況。其中，下肢運動功能評分以傾斜板評分和改良的Tarlov評分為主，傾斜板評分分值為1～5分，分值越高代表受損越嚴重;Tarlov評分分值為1～50分，分值越低代表受損越嚴重。

1.4統計學分析

利用Spss17.0統計軟件和Excel軟件進行分析。其中，計量采用x ?±s，計數的獨立樣本t檢驗。p<0.05代表存在顯著差異。

2.結果

2.1兩組大鼠的下肢運動評分

觀察組的IP評分和Tarlov評分均遜于對照組，存在顯著性差異（p<0.05），結果如下表所示：

2.2 miR-223-5p、BMP4與損傷程度

觀察組中大鼠的miR-223-5p的與其轉化的靶向蛋白，以及BMP4的陽性率與脊髓損傷之間存在顯著正相關（r=2.823，p=0.021），存在顯著差異，具有統計學意義。

3.討論

基礎實驗結果顯示：脊髓受損后，脊髓灰質與白質區的神經元受損程度不同。白質區域神經元損傷主要是由于繼發損傷所致。又有臨床研究顯示，繼發性脊髓損傷所致的神經細胞損傷經歷水腫、壞死和凋亡等過程，BMP4是白質區域神經元凋亡的主要蛋白。在白質神經元損傷過程中，分泌大量神經影響因子TNFR1、DR6，所以對影響因子的分析和檢測，可以判斷損傷的位置和原因，更好地為臨床治療提供幫助[3]。

3.1 脊髓損傷釋放大量miR-223-5p、BMP4

對照組大鼠脊髓組織相對比較密集，細胞核比較大，染色比較淺，且內核清晰。大鼠脊髓損傷后12h，出現片狀出血，且呈現壞死性囊腔，神經元水腫明顯，組織間隙較大，組織間的膠質細胞溶解，從影像學證實大鼠脊髓出現損傷。TNFR1、DR6是miR-223-5p轉錄后的靶向蛋白，基礎研究結果顯示，上述蛋白參與神經細胞的增殖、凋亡和分化，從基因角度證實大鼠脊髓出現損傷。BMP4屬于轉化生長因子-β范疇，是小膠質細胞增殖和活化的反應，出現于組織的炎癥反應后。脊髓損傷后出現一定的嚴重，受損組織周圍細胞壞死，凋亡，釋放大量的BMP4。本文研究結果顯示，觀察組大鼠的BMP4量顯著高于對照組，進一步說明脊髓損傷與BMP4有關。同時，部分研究結果顯示，神經組織損傷，或者缺血性損傷，會導致受損組織出現磷酸化，增加BMP4的釋放量。兩組大鼠在12h后，miR-223-5p釋放量增加，導致TNFR1、DR6的陽性率提高，而且組織的磷酸化使得BMP的釋放量進一步增強。由此可知，大鼠脊髓發生繼發性損傷后，TNFR1、DR6和BMP4的釋放量增加，進而陽性率提高。

3.2 miR-223-5p、BMP4促使損傷加劇

研究結果顯示，兩組大鼠的3h、6h和12h 后miR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR6， 以及BMP4均呈現增加趨勢，說明大鼠脊髓損傷后，炎癥反應逐漸增強。已有研究表明，在神經元損傷后，膠質細胞的凋亡加快，致使miR-223-5p轉錄表達增強，TNFR1、DR6的陽性率升高。研究的結果發現：在大鼠脊髓損傷3h時，觀察組和對照組的miR-223-5p的表達增加量差異較小，而在6h、12h時增加量飆升。同時，伴隨TNFR1、DR6表達的增強，BMP的表達也隨之急劇增加， 初步證實TNFR1、DR6與BMP4參與脊髓神經細胞的凋亡，與繼發性脊髓損傷相關。另外一個方面，脊髓損傷會增加周圍組織的磷酸化，使得BMP4的活性受到抑制，使得膠質細胞的增殖和活化能力減弱，進一步促進組織凋亡，增強損傷后的炎癥反應。大鼠的脊髓受損后，血液中炎性細胞數量激增，而炎性細胞與內皮細胞產生會產生活氧化物（ROS，reactive oxygen species）和炎性因子，本文研究結果中TNF-α、IL-1β和BMP4隨著大鼠脊髓損傷的加劇，三者的陽性率顯著提高。國內研究結果顯示，TNF-α、IL-1β是神經炎凋亡、脊髓白質的主要炎性介質，而且TNF-α與BMP4的結合，可以活化RIP1復合物參，使得脊髓受損組織出現再灌注血，增加組織內的炎性因子量。所以，本研究中，觀察組大眾的miR-223靶向蛋白TNF-α和IL-1β陽性率激增。另外，有研究結果顯示，BMP4是神經元組織間膠質消失的標志物，所以觀察組的BMP4在3h、6h和12h階段量顯著增加，而且在12h的增加量激增，提示隨著損傷的延長，脊髓中的神經元、神經纖維消失加快。12h時出現血液再灌注的問題，進一步增加組織的炎癥因子量，促使神經細胞消亡，加劇神經組織的損傷。

綜上所述，minR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR和BMP4與大鼠脊髓損傷程度正相關，可以作為SD大鼠脊髓損傷的提示指標。

參考文獻

[1] 滿朝來， 楊美玲. 體液循環microRNA的研究進展[J]. 中國生物工程雜志， 2014， 34（2）： 104-108.

[2] Koudstaal S， Oerlemans MI， Van der Spoel TI， Janssen AW， Hoefer IE， Doevendans PA，Sluijter JP， Chamuleau SA. Necrostatin-1 alleviates reperfusion injury following acutemyocardial infarction in pigs[J]. Eur J Clin Invest . 2015; 45：150-9.

[3] Linkermann A， Br?sen JH， Darding M， Jin MK， Sanz AB， Heller JO， De Zen F， Weinlich R，Ortiz A， Walczak H， Weinberg JM， Green DR， Kunzendorf U， Krautwald S. Twoindependent pathways of regulated necrosis mediate ischemia-reperfusion injury[J].Proc Natl Acad Sci U S A . 2013，22（15）：110：12024-9.

墊江縣技術研發與示范應用項目，項目名稱：miR-223-5p通過BMP4調節神經干細胞分化在脊髓損傷修復中的研究，項目編號：djkjxm2018jsyfysfyy031