荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞增殖、凋亡及前體脂肪細胞、成熟脂肪細胞IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的影響*

吳冬梅,張曉東

(1.河南省中醫院，河南 鄭州 450002； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)以持續無排卵、高雄激素含量和胰島素抵抗為特征[1-3]。PCOS患者主要表現為胰島素抵抗(insulin resistance,IR) 和代償性高胰島素血癥，是引起月經不調、閉經和不孕的常見原因之一，還與其他心腦血管疾病的發生密切相關[4-5]。遺傳因素、下丘腦-垂體-性腺軸功能失調、卵巢及腎上腺功能異常、胰島素抵抗、肥胖[6]都與PCOS的發病有聯系。脂肪組織是人體重要的能量穩態調節器，是觸發胰島素抵抗炎癥反應的重要場所，脂肪組織分泌功能紊亂在IR中扮演了重要的角色。荷葉是一種被廣泛研究的植物化學物，但其對前脂肪細胞增殖、分化、凋亡的影響，以及相關機制仍不明確。本研究檢測荷葉對3T3-L1脂肪細胞的影響，以期從分子生物學角度闡述荷葉降脂的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

荷葉，購自河南中醫藥大學第一附屬醫院藥房，水煮提取，高壓滅菌，制備中藥水溶性提取物(extracts of Chinese medical herbs,ECMH)，4 ℃備用。DMEM培養基，美國Gibco公司產品，批號12100046；胰蛋白酶(批號20160302)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，批號20150120)，均為北京Solarbio公司產品；熒光定量 PCR Mix(批號A25741)、逆轉錄試劑盒(批號18090050)，均為美國Thermo Fisher公司產品；TRIZOL試劑，美國Invitrogen 公司產品，批號15596026；胰島素(批號I0516)、地塞米松(DEX，批號D4902)、 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，批號17018)、油紅O(批號O0625)，均為美國Sigma公司產品。96孔細胞培養板，美國Costar公司產品，批號3516；OLYMPUS CK40 倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；CO2細胞培養箱，美國Thermo公司產品；高速臺式冷凍離心機，德國Herseus公司產品；ABI7300熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司產品；Milli-Q型超純水儀，美國Milipore公司產品。

1.2 細胞培養與傳代

3T3-L1細胞，購自上海細胞所。將 3T3-L1細胞在含有100 IU/L青霉素100 mg/L鏈霉素、體積分數100 mL/L 胎牛血清的DMEM培養基、37 ℃、體積分數50 mL/L CO2條件下培養。生長至90%傳代培養。取傳代2～3代后的細胞進行種板并進行后續實驗。

1.3 檢測指標

1.3.1 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞增殖的影響

采用MTT法檢測。細胞以1×105/mL密度接種到96孔板上，培養24 h至生長融合后將細胞分為正常對照組和質量分數為0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的荷葉水提物組。正常對照組細胞進行正常培養；荷葉水提物各組以質量分數為0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的荷葉水提物分別刺激3T3-L1前體脂肪細胞24 h，再更換含5 g/L MTT液無血清培養基90 μL，繼續培養4 h，然后用酶標儀測定490 nm處的吸光度。

1.3.2 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞和成熟脂肪細胞白介素-6(IL-6)信使核糖核酸(mRNA)、腫瘤壞死因子(TNF-α)mRNA的表達

采用熒光定量PCR檢測。將細胞接種于25 cm2培養瓶中，融合達到90%后隨機分2組。荷葉組：加入5 mL含1g/L的荷葉提取物。正常對照組：加入5 mL 普通培養基， 繼續培養24 h，處理結束后提取RNA；誘導分化的成熟脂肪細胞培養至第9天時按以上方法分組并加藥，培養24 h后清洗細胞，提取細胞RNA。所得各組RNA根據逆轉錄試劑盒操作逆轉錄成CDNA，熒光定量PCR儀進行擴增。實時熒光定量反應條件，95 ℃預變性90 s；進入PCR循環，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。擴增反應結束后，從65 ℃緩慢加熱到95 ℃，以建立PCR產物的熔解曲線，每個標本均設置復管PCR反應。以GADPH為內部對照，采用2-ΔΔCt相對定量法計算各組基因表達得出RQ 值進行計算和統計。

1.3.3 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡的影響

采用DAPI染色法檢測。DAPI染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察。正常的細胞核呈亮藍色熒光，細胞質無熒光。細胞發生凋亡時，細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染。方法如下：取對數生長的細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化成細胞懸液，接種到預先放置蓋玻片的24孔培養板中，置37 ℃、體積分數為50 mL/L CO2的孵箱中培養，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，進行分組。正常組：加入5 mL 含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養基。實驗組：加入5 mL含1 g/L的荷葉提取物。繼續培養24 h,取出蓋玻片，PBS漂洗2次;加入DAPI飽和工作液60 μL ，室溫避光作用10 min；PBS溶液洗滌3次，5 min/次；封片,在熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞增殖的影響

見表1。各質量分數的荷葉提取物均可不同程度地抑制細胞的增殖，且呈現量-效關系。與正常對照組對比,各荷葉提取物組的OD值降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結合10 g/L的荷葉水提物組出現皺縮、脫壁、細胞脫落現象，決定取質量分數為1 g/L的荷葉水提物進行后續實驗。

表1 不同質量分數荷葉水提對3T3-L1前體脂肪細胞增殖的影響

2.2 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞和成熟脂肪細胞 TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達的影響

質量分數1 g/L的荷葉水提物能降低3T3-L1前體脂肪細胞IL-6 mRNA 表達，能增高3T3-L1成熟脂肪細胞TNF-α、IL-6 mRNA的表達 ，與正常對照組對比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 荷葉水提物對前體脂肪細胞和成熟脂肪細胞 TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表達的影響

2.3 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡的影響

見圖1。正常對照組細胞在細胞核處發散微弱熒光，質量分數1 g/L的荷葉水提物組可見細胞凋亡。凋亡細胞的細胞核縮小、發散高亮熒光；細胞漿中可見局部稀疏亮點(線粒體DNA)。早期凋亡的細胞有明亮凋亡熒光。

A.正常對照組

B.1 g/L荷葉水提物組

3 討 論

多囊卵巢綜合征患者存在代謝異常，主要表現為肥胖、胰島素抵抗、糖耐量損害和血脂異常等。PCOS的高雄激素血癥及高胰島素可改變脂蛋白及膽固醇的代謝而產生高脂血癥，加重脂類代謝的異常，進一步導致動脈粥樣硬化發生[10]。脂肪組織在人體中是一個重要的能量穩態調節器，脂肪蓄積過多可能導致胰島素抵抗。肥胖癥與糖尿病、冠心病、高血壓、脂代謝紊亂及動脈粥樣硬化等疾病的發生密切相關，嚴重影響著人們的身心健康。脂肪組織的變化是肥胖癥發生的根本原因，脂肪組織能分泌一些特異性蛋白，在機體糖脂代謝中起著重要的調節作用，此成為治療肥胖癥的新靶點。IL-6是多功能炎性細胞因子,具有致炎和抗炎的雙向功能，在炎癥反應中起重要作用。其作用與組織中的含量有關,正常水平的白介素對機體有利,過多則會引起炎性損害。

MTT實驗結果顯示：0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的ECMH可不同程度抑制脂肪細胞的增殖，隨著藥物質量分數的升高，呈明顯的劑量-效應關系。與正常對照組對比，各質量分數的荷葉水提物都可以不同程度抑制細胞增殖，且質量分數越高，對脂肪細胞的抑制作用越強。但荷葉水提物質量分數過高，會使脫落細胞增多，因此實驗中選取1 g/L的ECMH進行熒光定量PCR實驗。熒光定量PCR結果顯示：1g/L的荷葉水提物能降低3T3-L1前體細胞IL-6 mRNA的表達，增高成熟脂肪細胞TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表達。DAPI染色實驗結果顯示：荷葉水提物可以顯著促進脂肪細胞的凋亡。