豬源金黃色葡萄球菌分離鑒定及16srRNA基因遺傳進化分析

張小冬 郭曉銀 王貴平 胡仕鳳 尹 崇

（湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙 410128）

1 前言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種人畜共患病原菌，在顯微鏡下呈現葡萄串狀。金葡菌可以引起豬多種感染，包括皮膚和組織感染、毒素介導的疾病和細菌性貧血。隨著抗生素的應用，細菌耐藥性大量增加，甚至出現對已有的抗生素都耐受的“超級細菌”，給臨床治療帶來了極大的困擾，嚴重威脅用藥及公共衛生安全。動物是金葡菌的“蓄水池”，調查動物源金葡菌具有重大公共安全和食品安全意義，可對醫學上治療金葡菌感染提供參考依據。本研究對湖南地區規模化豬場采集的300份病料，進行金葡菌的分離鑒定和16Sr RNA基因進化樹構建和分析。

2 材料與方法

2.1 樣品

2018.10-2019.9湖南地區養豬場采集的樣品300份，并做好詳細記錄。

2.2 主要試劑

血瓊脂培養基、凍干兔血漿和甲苯胺藍-DNA酶平板均購自青島海博生物技術有限公司；DNA試劑盒購自上海生工有限公司；7.5%氯化鈉肉湯培養基/固體瓊脂培養基實驗室配制。

2.3 主要儀器

PCR儀：美國A B公司；生物安全柜：力康發展有限公司；高速離心機：北京賽智創業科技有限公司；生物顯微鏡：奧林巴斯工業有限公司。

2.4 金黃色葡萄球菌分離培養

合理處理肺臟和拭子后，加入 7.5%氯化鈉肉湯培養基中，置變頻搖床37 ℃培養24 h。用接種環取菌液少許，在培養基上進行劃線，37 ℃培養24 h，然后挑取單菌落，在7.5%氯化鈉固體瓊脂培養基上純化培養獲得分離菌，挑取單個菌落革蘭氏染色。

2.5 生化試驗

分離菌觸酶試驗、糖（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和甘露醇）發酵試驗、VP試驗、血漿凝固酶試驗、溶血試驗和耐熱核酸酶試驗。上述試驗判定標準均參考伯杰氏手冊，簡單描述如下：觸酶試驗中有氣體產生，判為為陽性。糖發酵試驗和VP試驗反應中出現顏色變化判為陽性。溶血試驗出現溶血環判為陽性。血漿凝固酶試驗在凍干兔血漿生化管中出現凝固現象判為陽性。在耐熱核酸酶試驗中，甲笨胺藍-DNA瓊脂培養基中的小洞（灌滿菌液后培養24h）周圍出現淡紅色，判為陽性。

2.6 PCR鑒定

提取DNA為模板，用16S rRNA基因和nuc基因擴增分離菌。16s rRNA和nuc引物均由生工（上海）公司合成。將擴增PCR產物經1.0%凝膠電泳后，出現陽性條帶的，送去生工測序。測序結果經BLAST分析并構建進化樹。

3 結果與分析

3.1 形態學觀察

純化株在固體瓊脂培養基上，形成菌落厚不透明的菌落，革蘭染色結果顯示為直徑大小0.8μm左右，單個、成雙或成串的葡萄球狀的紫色球菌如圖1。

圖1 分離菌革蘭染色（1000×）

3.2 生化試驗

生化試驗結果見表1。所有分離株觸酶試驗、糖發酵試驗、VP試驗、溶血試驗和耐熱核酸酶試驗均為陽性。92.3%的分離株血漿凝固酶試驗為陽性。這些結果符合伯杰氏手冊（don et al，2014）中對金葡菌生化特性的描述。

3.3 PCR結果

對生化鑒定符合金葡菌生化特性的分離菌，利用16S rRNAPCR擴增，均擴增出1500bp大小的目的片段（圖2）。同時用金葡菌特異性基因—耐熱核酸酶nuc基因進行PCR檢測。

表1 65株分離菌生化結果

均擴增出557bp大小的目的片段（圖3）。隨機挑選部分菌株進行測序，在NCBI發現與Genbank公布的S.aureus相似度均高于99%，確定為分離菌均為金葡菌。

圖2 16s rRNA擴增結果

圖3 nuc基因擴增結果

3.4 16S rRNA基因系統發育樹

在金葡菌分離株中隨機挑選了5株菌株進行測序，BALST后在NCBI上傳了序列HN001-005登錄號分別為HN650258、MN650259、MN650260、MN650918、MN652637。并進 行了 16S rRNA基因進化樹的構建，進化樹表明HN001-005分離株與金葡菌的相似性為98.0%-100%，顯示分離菌HN001與金葡菌GHA10、分離菌HN002和分離菌HN003與金葡菌HAR1親緣性最近并在同一進化支上。

3.5 分離結果統計

所有用于分離金葡菌的樣品300份均來源于湖南省長沙市等9地（表2）。所有樣品中金葡菌總分離率為21.67%，其中肺臟分離率為21.52%，拭子分離率為21.79%；母豬分離率為19.71%，仔豬分離率為23.41%（表2）。建議豬源金葡菌分離的最佳樣品為仔豬肺臟和仔豬拭子。

表2 金黃色葡萄球菌菌株分離的統計

4 討論

豬葡萄球菌感染的主要致病菌為金葡菌。本文根據分離株形態、生化特性和16S rRNA基因以及金葡菌特異性基因—耐熱核酸酶基因nuc 合成引物進行PCR反應鑒定為金葡菌。在300份樣品金葡菌分離率為21.67%（65/300），其中肺臟分離率為21.52%，拭子分離率為21.79%；母豬分離率為19.71%，仔豬分離率為23.41%。仔豬分離要高于母豬的分離率，這可能是仔豬免疫力低于成年豬，也與養殖場飼養管理條件等因素有關。

金葡菌產生的凝固酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積，從而產生凝固現象。金葡菌形成的感染局部化與此酶有關。金葡菌引起血液感染的危險因素與誘因較多，包括因靜脈導管、 氣管插管、手術等促使機體屏障功能完整性遭受破壞等導致機體免疫功能下降等多種因素有關。從豬血液中分離金葡菌的報道較少，本研究從豬血液中分離金葡菌，在30份豬血液中金葡菌的分離為0%，可能是樣本數較少或該菌并沒有侵襲到血液中等，所以在豬身上血液感染金葡菌幾率比較低。

16S rRNA是核糖體上小亞基上的RNA，這段序列在不同細菌的結構、功能都具有高度保守性，完成測序后通過BLAST分析可以確定其同源性比較、用于細菌的系統分類鑒定、多樣性和親緣關系分析等。5株金葡菌的16S rRNA基因遺傳進化樹表明湖南省地區存在著多種不同型的菌株。本研究對湖南省地區豬養殖場采集的樣品進行金葡菌的分離鑒定和16S rRNA基因進化樹的構建對其感染情況和分布進行了調查，為預防和治療豬金葡菌的感染提供參考依據。