Nanopore 單分子測序基因組結構變異分析流程比較

王曦路

（復旦大學 生命科學學院，上海 200000）

0 引言

結構變異（Structural variant，SV）包括插入，缺失，重復，倒位和易位（一般定義為大于50bp）[1-3]。在基因組中存在的遺傳變異形式中，結構變異仍然是其功能影響最難以解釋的變異之一。一直以來基因組結構變異被認為與表型多樣性、人類疾病、基因多樣性以及大規模染色體進化等有關，但他們的影響仍未完全清楚。目前對于結構變異的功能影響的研究主要來源于人類疾病研究方面[1-5]。

從Sanger 測序到下一代測序（NGS），可以從測序數據中收集的信息量和豐富程度大大增加，同時測序成本急劇下降[6]。測序技術的進步使得對SNP 以及小的插入和缺失等變異的檢測和分析取得了長足的進展，但受限于讀長，使用NGS 進行SV 檢測仍然面臨許多困難[7]。以Oxford 開發的Nanopore 測序技術[8]以及Pacific Biosciences（PacBio）開發的SMRT 測序技術為代表的單分子測序技術的出現使得長讀長測序成為可能。借助單分子測序技術，近期已有多種遺傳病找到了相關SV。如：雙相情感障礙和精神分裂癥[9]，家族性皮質肌陣攣性震顫伴癲癇（familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE）[10]，神經元核內包涵體病（Neuronal intranuclear inclusion disease， NIID）[11-13]等。但單分子測序技術仍然存在一定的局限性，最主要的是較高的測序錯誤率和更加昂貴的成本[14]。因此，使用適當的分析方法以及覆蓋度進行檢測在減少錯誤和控制成本上就顯得尤為重要。

目前針對Naopore 測序數據可以使用的比對軟件主要有以下幾種：NGMLR[15]，BWA-MEM[16]，Graphmap[17]，Minimap2[18]。SV 發 現 軟 件 有NanoSV[19]和Sniffles[15]。Genome in a Bottle（GIAB）聯盟發布了針對NA12878 基因組的高可信度SV 集合（2676 個缺失SV 以及68 個插入SV）。這是一個由不同平臺進行深度測序得到的集合，并在家系中驗證準確率為99.7%，可以對數據分析流程進行性能驗證[20]。我們評估了四個比對軟件和兩個SV 發現軟件的組合性能。這將對Nanopore 測序在臨床及科研上的SV 檢測提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 研究使用的Nanopore 數據集。本研究使用的數據集來自GIAB 聯盟發布的基于Nanopore 測序平臺的NA12878基因組測序數據（https：//github.com/nanopore-wgsconsortium/NA12878）[21]。該數據由多家實驗室分別測序獲得。在獲得Fastq 數據后，以人參考基因組（NCBI build 37）作為參考序列（與高可信度SV 集合保持一致），分別以不同的覆蓋倍數（2-30×）進行隨機抽樣，將抽樣得到的Fastq 作為起始數據進行后續研究。

1.2 數據比對和發現SV。分別使用NGMLR（默認參數）[15]，BWA-MEM（bwa mem –x ont2d -M）[16]，Graphmap（默認參數）[17]和Minimap2（默認參數）[18]將抽樣的fastq 數據比對到人參考基因組（NCBI build 37）上，產生SAM 文件。

之后分別使用NanoSV[19]和Sniffles[15]進行SV 檢測，Sniffles 需要修改參數（最小reads 支持修改為2）以增加SV 檢測的靈敏度，如圖1 所示。

圖1 數據比對和發現SV 流程

1.3 性能評估。分別獲取各分析流程的各覆蓋度下的SV 集合與高可信度SV 集合的共識SV。以評判其準確度（檢測到的標準SV 中的SV 在該流程的得到的所有SV 中的百分比）和召回率（該流程檢測到的SV 在標準SV 中的百分比）。比較兩個SV 是否相同時，缺失SV 在基因組上顯示為一個區域，而插入SV 僅有一個斷點坐標，因此需要使用不同的標準。對于缺失SV，兩個缺失之間的重疊區域超過50%則認為它們是相同的。插入SV 的判斷在之前的研究中標準差異較大，如果兩個插入SV 之間相距不超過500bp，則認為兩個插入相同[22]。

2 結果

2.1 各流程在各覆蓋度下的SV 發現數量。為了確定Nanopore 數據中SV 檢測的最佳覆蓋度，我們使用抽樣的2×，4×，6×，8×，10×，12×，15×，20×，25× 和30×，在每個覆蓋度下分別使用NGMLR，BWA-MEM，Graphmap 和Minimap2 進行比對，之后分別使用NanoSV和Sniffles 進行SV 發現。各分析流程各覆蓋度下發現的SV數量如圖2 所示。隨著覆蓋度的增加，SV 的數量都在持續增加，這可能是由于Nanopore 本身的測序錯誤率較高導致的。但是除Minimap2 分析流程外，在超過20×之后，SV 的增量均有明顯的的降低，尤其是使用NanoSV 發現SV 的流程中更為顯著。

圖2 各分析流程各覆蓋度下發現的SV 數量

2.2 不同流程之間的性能差異。在所有流程中的召回率都是隨著覆蓋度的升高而增加，20×之后趨勢變緩。

30× 覆蓋度下對于缺失SV 的召回率最高的是NGMLR/NanoSV 流 程（ 召 回 率：96.936%， 準 確 率：2.368%）；而召回率最低的是Minimap2/Sniffles（召回率：18.984%，準確率：0.247%）。20×覆蓋度下，召回率最高為NGMLR/NanoSV（召回率：94.918%，準確率：2.463%），與30×下差異不大。

30× 覆蓋度下對于插入SV 的召回率最高的是Graphmap/NanoSV 流程（召回率：80.882%，準確率：0.119%）；而召回率最低的是Minimap2/Sniffles（召回率：19.118 %，準確率：0.006%）。20×覆蓋度下，召回率最高為Graphmap/NanoSV（召回率：77.941 %，準確率：0.122%），與30×下差異不大。

由此，結合成本和召回率考慮，選擇以20×左右的覆蓋度作為標準較為合適詳情加圖3，圖4。

圖3 各流程覆蓋度下對于缺失SV 的召回率

圖4 各流程各覆蓋度的召回率

3 討論

在本研究中，我們評估了目前常用于Naopore 測序數據分析的4 種比對軟件。以及兩種SV 發現軟件。我們發現對于nanopore 測序來說，20×的覆蓋度是在研究中比較適合的覆蓋度。同時，我們發現不同的分析流程之間結果會有很大的差異，對于缺失SV，20×覆蓋度下，召回率最高為NGMLR/NanoSV（召回率：94.918%，準確率：2.463%）；對于插入SV，20×覆蓋度下，召回率最高為Graphmap/NanoSV（召回率：77.941%，準確率：0.122%）

在發現SV 的數量上，Sniffles 與NanoSV 相比總體上差異不大，但Sniffles 可以發現復雜結構變異這一點上更具優勢。