CTGF和ELMO1多態(tài)性與2型糖尿病性腎病易感性的關(guān)聯(lián)研究

何志忠， 陳繼承， 王全興， 劉加河， 鄭曉軍

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是以胰島素分泌相對(duì)不足及胰島素抵抗為特征表現(xiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病。由于血糖控制不佳及患者對(duì)糖尿病認(rèn)知不足，T2DM所導(dǎo)致的心、腦、腎等大血管及微血管病變具有較高的發(fā)生率[1]。糖尿病性腎病(diabetic kidney disease，DKD)是T2DM患者最常見的微血管并發(fā)癥[2-3]。目前針對(duì)DKD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，多項(xiàng)研究均證實(shí)：引起DKD的主要原因包括遺傳、環(huán)境因素及長(zhǎng)期的糖代謝紊亂[4-6]。GWAS和相關(guān)薈萃分析已報(bào)道在不同人群中與DKD易感性相關(guān)的一些基因[7]。其中，吞噬和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1, ELMO1)基因的多態(tài)性與DKD具有相關(guān)性[8]，但其機(jī)制尚不完全清楚。部分研究表明，ELMO1基因的突變可導(dǎo)致細(xì)胞外間質(zhì)代謝紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的累積、腎小管和腎小球基底膜增厚，增加DKD的風(fēng)險(xiǎn)[9]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)在刺激系膜細(xì)胞增生、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成及促進(jìn)腎臟纖維化等方面發(fā)揮作用[10]。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類CTGF基因中有10個(gè)SNP，其中3個(gè)SNP位點(diǎn)可能存在一定的功能[11]。本研究采用imLDRTM多重SNP分型技術(shù)，探討CTGF基因rs2648875及ELMO1基因rs10951509多態(tài)性與DKD遺傳易感性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2017年1月—2018年6月就診筆者醫(yī)院的DKD患者195例(DKD組)。同時(shí)隨機(jī)選取筆者醫(yī)院體檢中心體檢的患者134例作為對(duì)照組，無(wú)DM、腎損害、高血壓病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等病史。T2DM診斷符合2017年2型糖尿病防治指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。DKD的診斷符合2019年中國(guó)糖尿病腎病疾病防治臨床指南[13]，由糖尿病引起的慢性腎病，主要包括尿白蛋白/肌酐比(albumin to creatinine ratio，ACR)≥30 mg/g持續(xù)超過(guò)3月和(或)伴腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate, GFR)<60 mL·min-1·1.73 m-2。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<30歲或>70歲；(2)合并高血糖高滲狀態(tài)、糖尿病酮癥酸中毒等其他嚴(yán)重并發(fā)癥者；(3)合并有嚴(yán)重的心、肝等并發(fā)癥；(4)因泌尿系感染、發(fā)熱、運(yùn)動(dòng)等因素導(dǎo)致的ACR升高者；(5)無(wú)持續(xù)蛋白尿而出現(xiàn)腎功能迅速惡化；(6)原發(fā)性腎小球疾病、高血壓病、心功能不全、血液病、自身免疫性疾病、腫瘤及藥物等導(dǎo)致的繼發(fā)性腎損害；(7)精神病患者。所有研究對(duì)象均為泉州市常住漢族人群，彼此間無(wú)血緣關(guān)系。本研究通過(guò)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1一般情況及生化分析 收集受試患者身高、體質(zhì)量、腹圍、血壓等情況，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)。采集空腹靜脈血，通過(guò)糖化血紅蛋白分析儀(H8，深圳普門科技股份有限公司)檢測(cè)糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin, HbA1c)水平。通過(guò)生化免疫流水線(Aptio，德國(guó)西門子公司)進(jìn)行空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)、甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、血清尿素氮(serum urea nitrogen, BUN)、血清肌酐(serum creatinine, Scr)、尿酸(uric acid, UA)等指標(biāo)檢測(cè)。收集晨尿，通過(guò)ACR尿液分析儀(720型，韓國(guó)賽寶公司)檢測(cè)患者尿液ACR水平。

1.2.2DNA提取 采集兩組患者的空腹外周靜脈血3 mL，采用中量全血基因組DNA提取試劑盒(DP2102，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行基因組DNA的提取。具體提取步驟參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。采用超微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop-2000，美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)基因組DNA純度和濃度，所有基因組DNA樣本的純度和濃度均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.3CTGF及ELMO1基因多態(tài)性分析 采用上海天昊生物科技有限公司自主專利研發(fā)的imLDRTM多重SNP分型試劑盒進(jìn)行CTGF基因rs2648875及ELMO1基因rs10951509多態(tài)性檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料比較 DKD組患者的腹圍及BMI，SBP，DBP，F(xiàn)PG，TC，TG，LDL-C，BUN較對(duì)照組顯著升高，HDL-C較對(duì)照組顯著降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1 兩組患者的一般臨床資料比較

2.2CTGF基因rs2648875多態(tài)性分析

2.2.1HWE檢驗(yàn)、基因型及等位基因分布比較 經(jīng)過(guò)似然比χ2檢驗(yàn)，兩組基因型頻率分布符合HWE(P均>0.05，表2)，證明所采集樣本人群具有良好的群體代表性。兩組患者AA，GA及GG基因型分布差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.639，P=0.013，表3)。DKD組風(fēng)險(xiǎn)等位基因A頻率較對(duì)照組升高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.220，P=0.007，表3)，其OR為1.183，95%CI為1.043～1.343。

表2 rs2648875基因型遺傳平衡定律檢測(cè)

表3 兩組患者rs2648875基因型及等位基因分布情況

2.2.2DKD組rs2648875多態(tài)性與臨床資料相關(guān)性分析 GG基因型患者TG水平較AA及GA基因型患者顯著降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表4 DKD組rs2648875基因型與理化指標(biāo)相關(guān)分析

2.3ELMO1基因rs10951509多態(tài)性分析

2.3.1HWE檢驗(yàn)、基因型及等位基因分布比較 經(jīng)過(guò)似然比χ2檢驗(yàn)，兩組基因型頻率分布符合HWE(P均>0.05，表5)，證明所采集樣本人群具有良好的群體代表性。兩組患者AA，AG及GG基因型分布差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.770，P=0.034，表6)。DKD組風(fēng)險(xiǎn)等位基因A頻率較對(duì)照組升高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.769，P=0.009，表6)，其OR為1.149，95%CI為1.031～1.281。

表5 rs10951509基因型遺傳平衡定律檢測(cè)

表6 兩組患者rs10951509基因型及等位基因分布比較

2.3.2DKD組rs10951509多態(tài)性與臨床資料相關(guān)性分析 AG基因型患者LDL-C水平較AA基因型顯著降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表7)。

表7 DKD組rs10951509基因型與臨床資料相關(guān)分析

2.4DKD危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析 以DKD為因變量，以性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腹圍、CTGF 3種基因型、ELMO1 3種基因型及BMI，SBP，DBP，F(xiàn)PG，TC，TG，LDL-C，HDL-C，BUN，Cr為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示吸煙史、腹型肥胖及SBP，F(xiàn)PG，BUN，CTGF-AA基因型為DKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表8)。

表8 DKD危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

3 討 論

20%～40%的糖尿病患者可并發(fā)腎臟損害，DKD是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要病因[14-15]。目前關(guān)于DKD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結(jié)果，其中遺傳因素是決定DKD易感性及嚴(yán)重程度的重要因素。本研究回歸分析發(fā)現(xiàn)，吸煙史、腹型肥胖及SBP，F(xiàn)PG，BUN為DKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但筆者發(fā)現(xiàn)，DKD的發(fā)生與患者血糖控制情況并未完全成正比，不能完全用血糖控制不佳解釋患者DKD的發(fā)生，且DKD具有明顯的家族聚集傾向及種族差別，存在DKD家族史患者并發(fā)DKD的風(fēng)險(xiǎn)為正常人的3倍[5,16]。同時(shí)，DKD患者同胞并發(fā)DKD的風(fēng)險(xiǎn)為無(wú)合并腎臟疾病糖尿病患者同胞的2.3倍，可見DKD具體明顯的遺傳傾向性。DKD發(fā)生的病理過(guò)程中，早期主要表現(xiàn)為腎小球肥大及基底膜增厚，同時(shí)合并系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)堆積及重構(gòu)，DKD后期主要表現(xiàn)為腎小球及腎間質(zhì)纖維化[17]。

人CTGF基因長(zhǎng)度約為3 kb，位于染色體6q23.1上，其含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，其5個(gè)外顯子分別編碼4個(gè)功能片段和CTGF的分泌信號(hào)肽。CTGF蛋白為即刻早期基因CNN家族中的一種細(xì)胞因子，為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的下游效應(yīng)因子，在腎臟中表達(dá)最高，在刺激腎小球系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成、導(dǎo)致腎小球硬化、促腎臟纖維化等方面發(fā)揮作用，參與DKD的整個(gè)病理過(guò)程[10, 18]。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)高糖刺激后，CTGF表達(dá)顯著升高，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化改變，腎間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)增高，降解減少，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度堆積，出現(xiàn)腎臟體積增大并最終發(fā)生纖維化[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，CTGF rs2648875基因DKD組等位基因A頻率較對(duì)照組升高(χ2=7.220，P=0.007)，表明CTGF rs2648875基因A等位基因?yàn)镈KD的易感基因(OR：1.183，95%CI：1.043～1.343)。進(jìn)一步行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，CTGF AA基因型為DKD獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Mason等研究認(rèn)為，CTGF rs9399005基因多態(tài)性可改變患者血清水平，是腎纖維化進(jìn)程中發(fā)揮多種生物學(xué)活性的有害細(xì)胞因子[22]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AA及GA基因型患者TG水平較GG基因型顯著增高(P<0.05)，推測(cè)CTGF rs2648875基因多態(tài)性可通過(guò)改變患者TG水平影響DKD的發(fā)生，這有待后續(xù)進(jìn)一步行蛋白組學(xué)研究證實(shí)。

人ELMO1基因位于染色體7p14.2上，包含22個(gè)外顯子及21個(gè)內(nèi)含子。ELMO1在死亡細(xì)胞吞噬、細(xì)胞形態(tài)改變及細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用[6]。在DKD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，ELMO1的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝失調(diào)，細(xì)胞黏附性降低，引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，出現(xiàn)腎小球和腎小管基底膜增厚，尿蛋白排出增多，引起慢性腎小球和腎小管損傷[9]。在ELMO1高表達(dá)的細(xì)胞中，細(xì)胞外基質(zhì)中纖連蛋白、I型膠原蛋白、整合素連接激酶和TGF-β表達(dá)均明顯增加，金屬蛋白酶表達(dá)明顯減少，促進(jìn)慢性腎小球損傷的發(fā)展[23]。另外，ELMO1可通過(guò)增強(qiáng)環(huán)氧化酶活性而增加纖連蛋白的表達(dá)，引起腎小球中細(xì)胞外基質(zhì)不斷沉積，進(jìn)一步加重腎小球損害[24]。2005年，Shimazaki等通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析首次證實(shí)ELMO1基因多態(tài)性與日本人群DKD的發(fā)生具有相關(guān)性[8]。Hanson等在亞利桑那州的印第安人中研究發(fā)現(xiàn)，位于ELMO1內(nèi)含子13的rs10951509 A等位基因和rs1345365A等位基因與DKD的發(fā)生具有明顯關(guān)聯(lián)性[25]。本研究在漢族人群中的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，ELMO1 rs10951509基因DKD組等位基因A頻率較對(duì)照組升高(χ2=6.769，P=0.009)，表明ELMO1 rs10951509基因A等位基因?yàn)镈KD的易感基因(OR：1.149，95%CI：1.031～1.281)。而我國(guó)一項(xiàng)在新疆維吾爾族人群中的研究發(fā)現(xiàn)，ELMO1 rs10951509基因G等位基因?yàn)镈KD易感基因[26]，與本次研究及國(guó)外研究相反，考慮與種族、樣本量及地域差別等因素有關(guān)。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AA基因型患者LDL-C水平較AG基因型顯著升高(P<0.05)，較GG基因型患者升高，但無(wú)顯著性差別，ELMO1 rs10951509基因多態(tài)性是否影響患者LDL-C水平，有待后續(xù)增加樣本量研究證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CTGF rs2648875基因A等位基因及ELMO1 rs10951509基因A等位基因與DKD的發(fā)生相關(guān)。吸煙史、腹型肥胖及SBP，F(xiàn)PG，BUN，CTGF-AA基因型為DKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。DKD的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，遺傳背景在不同種族人群中差別很大，所產(chǎn)生的SNP位點(diǎn)作用強(qiáng)度也不同，同時(shí)多個(gè)SNP位點(diǎn)之間也可相互影響，生活飲食、居住環(huán)境、實(shí)驗(yàn)樣本量等均可影響相關(guān)研究結(jié)果。本研究?jī)H從小量樣本及部分SNP位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，因此進(jìn)一步研究CTGF及ELMO1多態(tài)性與DKD的相關(guān)性，仍需進(jìn)行不同種群之間的多中心研究以及多位點(diǎn)之間的交互研究。從基因?qū)W角度進(jìn)行研究有助于DKD疾病的早期篩查、預(yù)防、延緩病情進(jìn)展及對(duì)藥物治療提供新靶點(diǎn)。