Ki-67在肺非典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤性腺癌及浸潤性腺癌中的表達差異

胡文鏵 吳愛兵 李媛媛 謝健龍 王永存▲

1.廣東醫科大學附屬醫院病理科，廣東湛江 524000；2.廣東醫科大學附屬醫院腫瘤中心，廣東湛江524000；3.廣東省農墾中心醫院腫瘤內科五區，廣東湛江 524002；4.廣東醫科大學附屬醫院心胸外科，廣東湛江524000

肺癌為當前臨床中發生率最高的惡性腫瘤，我國每年約有1090萬新確診癌癥，其中有135萬例屬于肺癌，而且病死率也居于癌癥的首位[1]。其中，肺腺癌為肺癌常見的一種病理類型，主要是指來源于支氣管黏膜上皮細胞的肺部癌灶。有研究指出[2]，肺腺癌患者即使病理分期、治療手段相同，其復發率、轉移率也會有顯著的差異，而尋找此種差異出現的原因，能夠有助于臨床客觀地判斷患者的預后。因此，積極尋找獨特的預后評估因子對于指導臨床治療具有重要的意義。細胞核相關抗原Ki-67是一種目前應用最廣泛的增殖細胞標志物[3]。相關研究報道[4]，Ki-67作為一種核增殖抗原，其在肺癌中的研究有著廣闊的前景，特別是在肺癌早期診斷、靶向治療及其預后判斷都有很高價值。現為進一步探討Ki-67在肺不典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤性腺癌、浸潤性腺癌中的表達差異及其與臨床病理因素的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

按照2011年國際肺腺癌研究學會（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）等公布的多學科肺腺癌新分類[5]，選取2010年1月～2019年1月廣東醫科大學附屬醫院、農墾中心醫院確診的93例癌前病變/肺腺癌患者進行研究，18例肺非典型腺瘤樣增生患者中男9例，女9例，年齡51～85歲，平均（66.0±11.0）歲；25例原位腺癌患者中男12例，女13例，年齡49～82歲，平均（66.5±10.5）歲；22例微浸潤性腺癌患者中男14例，女8例，年齡52～84歲，平均（67.0±10.0）歲；28例浸潤性腺癌患者中男17例，女11例，年齡46～80歲，平均（66.0±11.0）歲，四種病理類型的年齡、性別資料比較無統計學差異（P＞0.05）。入組標準：（1）首次診斷，且經病理復檢確診；（2）臨床資料齊全。排除標準：（1）既往有肺部手術史；（2）診斷不明；（3）納入研究時伴有嚴重感染性疾病。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 DAB顯色試劑（編號002941，美國Dako公司）；大鼠抗人Ki67單克隆抗體（貨號 00006140，克 隆 號 MIB-1，Dako公 司）；Dako autostainer link48自動組織染色機購自丹麥Dako公司；OLYMPUS CX22雙目顯微鏡。

1.2.2 標本采集 均在手術后取適量肺部病變組織作為實驗標本，取材后將其置于10%中性福爾馬林溶液中固定，并予以石蠟包埋，制作成厚度為4μm的連續切片。

1.2.3 檢測方法 （1）根據1∶50比例配制好抗原修復液，置于全自動免疫組化預處理系統中進行預處理，將其加熱到65℃，隨后把切片置于抗原修復液中；（2）將抗原修復液加熱到95℃，時間20min，隨后降溫至65℃，取出切片置于洗脫緩沖液浸泡5min；（3）將切片置于組織染色機上進行染色，并加入適量過氧化物酶阻斷劑，5min后用洗脫緩沖液沖洗；（4）滴加一抗→二抗，并用洗脫緩沖液沖洗，然后用DAB顯色劑顯色→蘇木素染色液復染；（5）將切片置于70%酒精→80%酒精→90%酒精→100%酒精→100%酒精中各2min，隨后重復進行2次二甲苯透明5min，封片。在顯微鏡下觀察、統計試驗結果。與此同時，選擇PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 結果判定[6]若細胞核內有棕黃色或深棕黃色顆粒可判斷為陽性表達，每個標本切片在光鏡高倍視野（×400）下選5個細胞增殖較為旺盛的視野計算陽性細胞數，每個視野的陽性細胞百分比=陽性表達細胞數量/總細胞數量×100%。

1.3 觀察指標

（1）比較不典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤腺癌、浸潤性腺癌肺組織中Ki-67表達差異；（2）比較不同分化程度、侵襲轉移、淋巴結轉移程度中Ki-67表達差異。

1.4 統計學方法

應用SPSS19.0統計學軟件，采用χ2檢驗，計量資料Ki-67表達水平的統計描述采用（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較應用方差分析，兩兩比較比較采用LSD-t檢驗。相關性分析采用Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同病理類型Ki-67表達水平差異

Ki-67在肺非典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤性腺癌及浸潤性腺癌中的表達水平逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同病理類型Ki-67表達水平差異

2.2 肺浸潤性腺癌中Ki-67表達與相關臨床病理因素的關系

本研究28例肺浸潤性腺癌患者中，不同組織學分級之間的Ki-67表達水平差異有統計學意義（P＜0.05），但Ki-67表達在有無淋巴結轉移、腫瘤侵襲轉移不同程度中的比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表2。而且經Spearman相關性分析，Ki-67表達與淋巴結轉移與否、侵襲轉移程度均無相關性（r=0.052，P=0.792；r=0.098，P=0.542），但與組織學分級呈顯著的負相關（r=-0.527，P=0.004）。

表2 肺浸潤性腺癌中Ki-67表達與相關臨床病理因素的關系

3 討論

隨著空氣環境污染的加重以及吸煙人數的逐年升高，肺癌成為我國第一大癌癥，而且由于肺癌的早期表現不明顯，在臨床首次確診病例中有80%已發展為晚期[7]。目前，肺腺癌發病率不斷攀升，已經超過肺鱗狀細胞癌，肺腺癌的精準化治療越發重要，而精準化治療的堅強后盾即需精準化的病理診斷。其中，Ki-67為當前臨床中較為常用的一項腫瘤檢測指標，有學者[8-9]認為，按照WHO提出的肺腺癌多學科分類的內容和新標準，探討Ki-67在肺腺癌組織中的表達情況及相關性有助于臨床更清楚地了解肺腺癌的生物學行為，進而為疾病診治以及預后評估提供相關參考依據。

Ki-67最早是在霍奇金淋巴瘤小鼠的免疫系統中發現的，將其納入到單克隆抗體范疇。而隨著對其研究的不斷深入，發現Ki-67的分子結構由分子量分別為395KD、345KD的兩條多肽鏈所組成，屬于一種與細胞增殖密切相關的核蛋白，且其生物功能與RNA轉錄有關，故有學者[10]提出，Ki-67活性降低可以抑制核糖核酸RNA合成。近年，Ki-67蛋白活性已成為各種惡性腫瘤研究的熱門生物指標之一，主要是通過檢測病變組織Ki-67陽性表達水平來了解其癌細胞增殖活性[11]。當前臨床，免疫組化檢測方法是了解Ki-67蛋白表達情況繼而用以評估癌細胞增殖程度最可靠的手段[12]。牛聰等[13]采用免疫組化手段對比肺癌組織、癌旁組織、肺部良性病變組織中Ki-67陽性表達情況，結果發現肺癌組織的Ki-67樣本表達顯著升高。張連美等[14]研究也顯示，非小細胞肺癌組織的Ki-67陽性表達率較癌旁組織要高，且表達高低與淋巴結轉移、TNM臨床分期密切相關，而與癌灶大小、位置等無相關性。本研究結果也發現，Ki-67在非典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤性腺癌及浸潤性腺癌組織中的表達水平逐漸升高，提示Ki-67高表達時能夠導致腫瘤細胞異常增殖。此外，本研究還發現，Ki-67表達水平與組織學分級有顯著的相關性（P＜0.05），但與淋巴結轉移、腫瘤侵襲轉移無明顯的相關性（P＞0.05），提示Ki-67表達與肺腺癌的增值生長程度有著正相關性，故檢測該指標有助于輔助預測肺腺癌的生物學行為，為患者的預后判斷提供參考依據。但本研究結果與韓義明等[15]研究不同，其提出Ki-67表達與肺腺癌腫瘤細胞的生長、侵襲轉移及淋巴結轉移呈正相關，筆者推測這有可能與樣本量大小、地區差異等有關。

綜上所述，Ki-67高表達為肺腺癌發生的主要分子事件，可參與腫瘤發展，但具體機制仍有待進行大樣本、多中心、多因素分析。