“培土生金法”對早期支氣管哮喘幼鼠氣道炎癥影響分析

劉克偉 陳英妹 甄如義

廣州市花都區婦幼保健院 （胡忠醫院）兒科，廣東廣州 510800

支氣管哮喘是一種常見的兒童疾病，近年來可能由于城市化水平的推動，空氣污染水平上升，導致該疾病發病率有一定上升趨勢[1]。該疾病的鑒別診斷有一定難度，且嬰幼兒哮喘反復發作患兒使用糖皮質激素、白三稀受體拮抗劑治療方法存在爭議，尋找一種切實可行的方法治療嬰幼兒哮喘一直是兒科中的熱點問題[2]。本研究通過幼鼠模型，探討“培土生金法”對其氣道炎癥改善情況，旨在探討兒童哮喘的藥理機制，現報道如下。

表1 Underwood組織病理學評分標準

1 資料與方法

1.1 研究對象及所需藥物

1.1.1 研究對象 由廣州中醫藥大學生物學研究所動物中心提供30只無特定病原體10d雌性幼鼠納入研究。

1.1.2 所需藥物 （1）Amresco品牌雞卵清蛋白，CAS編號：9006-59-1；（2）Elabscience品牌小鼠IL-10、IL-17及TGF-β1酶聯免疫吸附測定試驗盒；（3）異功散：人參、白術、茯苓、廣陳皮、甘草各取一份配成水煎劑，制成生藥質量濃度1g/mL的溶劑；（4）常樂康膠囊：山東科興生物制藥有限公司，S20020015，420mg×12 粒。

1.2 方法

幼鼠首先進行環境適應性喂養3d，后分為正常對照組、模型組、常樂康組、異功散低量組、異功散中量組及異功散大量組六組，每組5只幼鼠。所有幼鼠于1、13d進行腹腔注射，正常對照組幼鼠注射生理鹽水0.2mL，其余五組幼鼠均注射10%卵清蛋白（OVA）溶液0.1mL、等體積佐劑液態鋁混合進行致敏。隨后于20～22d將進行致敏的幼鼠放置于密閉容器霧化吸入20min質量分數3%的OVA溶液，正常對照組幼鼠吸入生理鹽水，1次/d，幼鼠出現煩躁、噴嚏、抓鼻、前肢縮抬、呼吸短促、腹部凹陷等情況視為哮喘造模完成。

同時于造模開始時間起，1次/d從口腔灌注藥物直至造模結束，參照《實驗藥理方法學》換算藥物劑量，大量組給予20g/kg劑量的異功散、中量組給予10g/kg的異功散、低量組給予5g/kg的異功散。常樂康組使用420mg/次常樂康菌粉稀釋為25mL/kg溶液從口腔灌服。模型組、正常對照組幼鼠灌服同等劑量生理鹽水。

所有幼鼠在末次激發后24h麻醉致死，剖開胸腔分離肺組織用注射器沿氣管插管，生理鹽水清潔左肺、支氣管肺泡灌洗液（BALF）3000r/min離心5min取上清液，-80℃保存。肺組織病理觀察：取右肺組織脫水包埋，切片進行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。IL-10、IL-17及TGF-β1：采用Elisa方法進行測定。

1.3 評分標準

用Underwood的標準對肺組織病理學改變進行評分[3]，具體評分標準見表1。

1.4 統計學方法

采用SPSS21.0統計學軟件對本研究數據進行分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗，多組間均數比較采用F檢驗，多組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學變化

正常對照組肺組織僅見少量炎癥細胞浸潤、無明顯組織損傷、無水腫、上皮細胞完整；模型組可見重度炎癥細胞浸潤、膿腫形成、組織壞死、上皮細胞黏液增多；常樂康組存在中度炎癥細胞浸潤、組織有一定損傷、輕微水腫；大量異功散組炎癥細胞浸潤程度低、少量上皮細胞脫落；中量異功散組炎癥細胞浸潤程度中等、上皮細胞有一定脫落、存在水腫；低量異功散組炎癥組織浸潤程度較重、存在水腫、上皮細胞脫落較多。見圖1。

Underwood肺組織病理學評分顯示模型組評分顯著高于正常對照組、常樂康組、異功散大量組、異功散中量組、異功散低量組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.2 IL-10、IL-17及TGF-β1指標比較

模型組支氣管肺泡灌洗液中IL-10含量較低，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；TGF-β1、IL-17含量與正常對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；常樂康組、異功散組IL-10含量均高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；異功散低劑量組IL-10與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；異功散低劑量IL-17與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 各組肺組織病理變化情況

表2 肺組織HE染色underwood評分比較（x ± s，分）

3 討論

在中醫中，認為哮喘主要是由于伏痰留飲導致的，同機體脾臟間具有顯著關系，機體肺、脾具有相互依賴、調節氣血津液、水液代謝的作用[4]。肺主氣，脾益氣；肺主行水，脾主運化水濕。故肺與脾的病理關系主要表現在氣和水液代謝功能異常方面，脾肺相關的哮喘理論在中醫肺系系統疾病中具有重要的理論支撐作用[5]。

表3 支氣管肺泡灌洗液IL-10、IL-17及TGF-β1指標比較（x ± s，pg/mL）

兒童在中醫理論中認為臟器較為嬌嫩，行氣未充，通常來講，兒童的支氣管哮喘都不是由單純的腎虛引發，多和脾虛、肺常不足具有聯系[6]。“培土生金法”即補脾（土）益氣而達到補益肺（金）氣的方法，適用于脾胃虛弱，不能滋養肺而致肺虛脾弱之證[7]。異功散方劑出自《小兒藥證直訣》，又稱為五味異功散、錢氏異功散，其記載“主治脾虛氣滯、飲食減少、胸脘痞悶、食入作脹、大便溏薄、神疲氣短、身體羸瘦、或面部浮腫者。”該方劑脫胎于四君子湯，在其基礎上加用了陳皮，旨在取得行氣化滯，醒脾助運之功用，在小兒“脾常不足”上正好對癥，該方劑在我國已被廣泛加以應用[8]。對于支氣管哮喘的發病機制，Th1及Th2平衡失調理論已經難以站住腳跟，在相關研究[9]中表明CD4+CD25+Foxp3+調節性T淋巴細胞（Treg）同Th17之間存在密切聯系。Treg細胞作為機體免疫反應程序中的關鍵性調節因素，其能夠誘導機體產生免疫性耐受，IL-10及TGF-β因子都可以起到T細胞增殖的抑制作用，同時也能對Th1/Th2細胞因子反應進行抑制[10]。Th17細胞可以分泌IL-17，進而對人體上皮細胞產生刺激，隨后分泌出趨化因子更加重中性粒細胞的浸潤作用，最終導致氣道炎癥[11]。可見Th17及Treg是過敏性疾病（包括哮喘）的重要誘導因素，同時，在機體早期，Treg/Th17能夠直接受到微生物的影響，極易對機體（幼鼠或人體）腸道菌群/黏膜免疫的正常構建產生影響[12]。在彭吉祥等[13]的研究中指出，雙歧桿菌可以平衡Treg/Th17細胞亞群數量，促進Treg型細胞因子表達，從而抑制Th17型細胞因子分泌[14-15]。在本研究中，異功散對早期支氣管哮喘幼鼠進行干預能夠改善其炎癥反應，幼鼠的炎癥反應改善程度與異功散劑量有直接關聯，揭示異功散在支氣管哮喘的治療和預防中具有正面作用，能夠提高IL-10含量，但IL-17含量并未發現顯著關聯性。

綜上所述，異功散對于支氣管哮喘具有一定的防治作用，但其對Treg/Th17的平衡作用仍待進一步的考證。