miR-93在胃癌患者血清中的表達變化及與臨床病理特征和預后的關系

張敏 莊偉 王敏 徐鳳玲 任傳濤

胃癌是全球范圍內發病率較高的一種消化道惡性腫瘤，發病與環境、飲食等因素有關，但至今其具體發病機制尚不明確。由于缺乏早期特異性表現，多數胃癌患者就診時己進入中晚期，患者預后往往較差[1,2]。因此，尋找早期篩查胃癌的生物學標志物，對于改善胃癌預后具有重要意義。有研究表明，miR-93參與了結腸癌等惡性腫瘤的發生發展[3]。相關文獻報道，miR-93在子宮內膜癌、乳腺癌等組織中起到促癌基因的作用，但目前有關miR-93在胃癌患者血清中表達變化及其與患者臨床病理特征和預后關系的研究甚少[4,5]。因此，本研究采用實時熒光定量(qRT-PCR)檢測胃癌患者血清中的miR-93水平，并分析探討miR-93與胃癌患者臨床病理特征及預后的關系，結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月至2016年5月在我院接受手術治療的胃癌患者88例，其中男59例，女29例;平均年齡(60.8±15.7)歲。選取同期來我院體檢的60例健康人為對照組，其中男41例，女19例;平均年齡(59.2±19.1)歲。2組年齡、性別比差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①有明確的術后病理診斷結果；②近期內未曾接受過放化療或手術治療者；③病例資料及隨訪資料完整者；④患者均已簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①合并其他器官惡性腫瘤者；②合并有炎癥內分泌代謝疾病及肝腎功能疾病者。

1.3 主要試劑及儀器 miRNeasy Serum/Plasma Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit均購自德國QIAGEN公司；LightCycle 96 熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；超低溫冰箱購自美國Thermo Scientific公司。miR-93及內參U6引物購自廣州銳博生物公司。

1.4 檢測方法 受試者空腹采集靜脈血5 ml,3 500 r/min離心30 min，將上層上清液轉移至Eppendorf (EP)管中，-80℃低溫冰箱保存備用。嚴格按照miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒說明書提取總RNA，分光光度儀檢測總RNA的純度和濃度。根據逆轉錄試劑盒miScript II RT Kit說明書操作逆轉錄合成cDNA。取cDNA應用miScript SYBR Green PCR Kit進行實時定量PCR 反應。引物序列：miR-93上游引物5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游引物5’- ACGUGACACGUUCGGAGAAATT-3’；U6上游引物5’- TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物5’- CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。反應條件：95℃ 10 min，95℃ 10 min，60℃ 1 min，擴增45個循環。以U6為參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-93的相對表達量。

1.5 隨訪 采用電話或門診的方式每3個月隨訪記錄患者的生存情況，隨訪截止至2018年12月止。

2 結果

2.1 2組血清中miR-93的檢測 qRT-PCR結果顯示，胃癌組血清中miR-93相對表達水平為(4.25±0.25)2-ΔΔct明顯高于對照組(0.97±0.06)2-ΔΔct，差異有統計學意義(t=99.590,P<0.05)。

2.2 miR-93表達變化與胃癌臨床病理特征的關系 以胃癌患者血清miR-93表達水平的中位值為截斷值，將患者分為miR-93高表達組44例和mi-93低表達組44例，統計分析顯示胃癌患者血清miR-93表達與腫瘤直徑、病理分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及浸潤深度等有關(P<0.05)，而與年齡、性別等無關(P>0.05)。見表1。

表1 miR-93表達變化與GC臨床病理特征的關系 例

2.3 血清miR-93對胃癌的診斷價值 ROC曲線結果顯示，miR-93診斷胃癌時ROC曲線下面積(AUC)為0.975(95% CI為0.960～0.991，P<0.05)。最佳診斷值為1.597時，靈敏度為93.7%，特異度為92.4%。見圖1。

圖1 血清miR-93診斷胃癌的ROC曲線

2.4 回歸分析 Cox 回歸分析結果顯示：淋巴結轉移及miR-93表達是影響胃癌患者預后的獨立因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響胃癌患者預后的Cox 回歸分析

2.5 血清miR-93水平對胃癌預后的判斷價值 Kaplan-Meier生存分析結果顯示，血清miR-93高表達組胃癌患者總生存率明顯低于血清miR-93低表達組胃癌患者(P<0.05)。見圖2。

圖2 血清miR-93高、低表達組胃癌患者生存曲線

3 討論

胃癌是一種好發于老年人的惡性腫瘤，該病起病隱匿，多數患者發現時已進入進展期或晚期，為治療增加了一定的難度。臨床治療胃癌通常以化療、手術治療為主，但患者5年生存率仍不理想[6,7]，因此及早發現胃癌，對于提高患者生存率意義重大。有研究表明，作為小分子非編碼RNA的miRNA可以參與細胞生長、分化及多種腫瘤的進展過程[8,9]。miRNA是一類在廣泛存在于人體中的小片段非編碼 RNA，不易被酶降解，可在血清中穩定存在，且不易受到外界環境因素的影響，因此，臨床中可將血清中異常表達的miRNA作為診斷腫瘤及預測預后的分子標記物。目前已經發現許多血清中異常表達的miRNA可以作為惡性腫瘤早期診斷及預后判斷的分子標志物。陳劍等[10]研究發現miR-183在食管鱗癌患者血清中表達明顯增高，并且與腫瘤的TNM分期有關，血清miR-183能夠明顯提高食管鱗癌的診斷效率。在胰腺癌患者血清中發現miR-196a和miR-210表達異常增高，并且與胰腺癌患者的生存時間相關[11]。王丹等[12]發現肝細胞癌患者血清中miR-187-3p可能成為早期診斷及預后判斷特異敏感的生物標志物。

目前國內外學者對胃癌的研究中也發現了許多血清中異常表達的miRNA。王靜等[13]發現血清中miR-223對胃癌有著良好的早期診斷效能。陳卿奇等[14]研究發現胃癌患者血清miR-132及miR-183異常高表達，可作為胃癌早期診斷的新型腫瘤標記物。但至今尚未發現令人滿意的胃癌血清miRNA預測標志物[15]。miR-93屬于miR-106b～25 miRNA簇重要成員，研究發現miR-93在消化道惡性腫瘤組織中表達異常，可能與腫瘤的發生進展有關[16]。本研究結果顯示：胃癌患者血清中miR-93水平較對照組明顯升高，提示miR-93在胃癌的發生發展中可能起著癌基因的作用。有研究表明miR-93作為癌基因發揮作用，能夠促進細胞周期的G1/S期轉換從而促進癌細胞的生長[17]。但另有研究發現：miR-93在神經母細胞瘤中表達降低，作為抑癌基因發揮作用，能夠抑制癌細胞的遷移能力和侵襲潛能[18]。原因可能為：miR-93在不同類型的腫瘤中通過不同的下游分子靶向通路起作用，存在明顯的異質性。Li等[19]也發現miR-93在胃癌組織和細胞系中表達升高，能夠促進胃癌細胞的惡性生物學行為，但是未對胃癌患者血清中miR-93表達水平進行研究。

本研究結果進一步顯示，隨著腫瘤直徑擴大、病理分化程度降低、TNM分期進展及淋巴結轉移，血清miR-93表達水平則隨之升高，說明 miR-93在胃癌中可能發揮癌基因的作用。本研究結果還顯示血清miR-93診斷胃癌時ROC曲線下面積(AUC)為0.975，通常AUC>0.9則表明診斷效能較高，提示miR-93對于早期胃癌的早期診斷價值較高，可作為胃癌早期診斷的敏感生物學指標。本研究曾指出，在非小細胞癌組織中，miR-93表達顯著上調，高表達患者5年總生存率低[18]。本研究結果也顯示，與血清miR-93低表達組比較，血清miR-93高表達組胃癌患者預后較差。Cox 回歸分析結果顯示：淋巴結轉移及miR-93表達水平是影響胃癌患者預后的獨立因素。提示血清miR-93高表達與胃癌患者的不良預后密切相關。

綜上所述，胃癌患者血清中miR-93異常高表達，血清中miR-93可以作為早期診斷胃癌的血清生物學標志物，且可作為胃癌患者預后的預測指標。