MEKK3與宮頸癌患者凋亡抑制基因bcl-2表達的相關性研究

蔣丹 舒楚強 龔穎萍

近些年隨著生活壓力的增大，宮頸癌的發生持續增高，逐漸呈現年輕化的趨勢，對我國的女性的身心健康及生活質量產生了重大影響[1,2]。但目前臨床上常應用的脫落細胞檢測對宮頸癌的陽性預測率較低，因此尋找有效診斷宮頸癌發生發展的分子標志物對患者的早期診斷、治療尤為重要。有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(MEKK3)屬于一種有絲分裂原活化蛋白3激酶家族中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MEKK3會在溶血磷脂酸、白細胞介素-1的介導下會激活細胞外信號調節激酶、p38、JNK所在內的MAPKs、核轉錄因子信號通路，通過激活上述通路，調節通路信號因子，參與腫瘤的發生發展過程[3]。B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)屬于一種凋亡抑制基因，可對細胞的凋亡進行抑制，bcl-2通過抑制細胞的凋亡而促進細胞的增殖，核轉錄因子被激活后會對bcl-2起到調控作用，參與腫瘤的發生[4]。在本文研究中檢測MEKK3在宮頸癌患者中的表達，并分析MEKK3與凋亡抑制基因bcl-2的相關性，為臨床上宮頸癌的診斷提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年12月我院收治的宮頸癌患者30例，年齡30～65歲，平均年齡(43.9±2.3)歲；鱗癌21例，腺癌9例；FIGO分期Ⅰ期患者5例，Ⅱ期患者8例，Ⅲ+Ⅳ期患者17例；肌層浸潤>1/2患者16例，肌層浸潤≤1/2患者14例；低分化患者10例，中-高分化患者20例。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：所有患者均病理學確診患有宮頸癌，均未接受過放療、化療、免疫治療。

1.2.2 排除標準：排除合并其他腫瘤的患者；排除病歷資料不全患者。本文研究患者及其家屬均知情，簽署知情通知書。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：取所有宮頸癌患者手術切除癌組織及癌旁組織標本，將制作的組織標本采用40 g/L的多聚甲醛進行固定，并進行常規石蠟包埋，厚度為3 μm，連續切片作免疫組化標記。正常結腸黏膜組織，通過活檢取塊進行制作標本。采集患者血液樣本，使用轉速為2 000 r/min的離心機，離心處理20 min，分離血清，放入潔凈的EP試管中，在-20℃環境中保存，待用。

1.3.2 免疫組化染色:將石蠟切片樣本放在二甲苯中脫蠟處理10 min，將二甲苯更換后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修復液，在37℃的恒溫冰箱中孵化30 min，棄抗原修復液；切片移入濕盒中加入濃度為3%的H2O2，去過氧化物酶封閉液，恒溫冰箱孵育10 min，采用PBS淋液沖洗；加入適量的山羊血清，在室溫環境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS淋液沖洗；經過DAB顯色處理10 min，在顯微鏡下觀察陽性反應，之后脫水并封片處理。

1.3.3 結果判定:MEKK3在細胞質中有藍紫色顆粒沉著為陽性，bcl-2在細胞漿或細胞核為黃色或棕褐色為陽性。按照免疫組化染色顯色程度、陽性細胞占癌細胞、癌旁細胞的百分率進行判定陽性表達率，其中陽性細胞數≥10%、顯色較強的為陽性，反之為陰性。

1.4 統計學分析 應用SPSS 20.0統計軟件，其中計數資料采用百分率描述，組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用F值檢驗，P<0.05則說明差異具有統計學意義。相關性采用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 MEKK3、bcl-2在宮頸癌癌組織及癌旁組織中的表達比較 宮頸癌癌組織中MEKK3、bcl-2陽性表達率均高于癌旁組織，具有統計學差異(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 MEKK3、bcl-2在宮頸癌癌組織及癌旁組織中的陽性表達比較 n=30,例(%)

MEKK3癌組織 MEKK3癌旁組織

bcl-2癌組織 bcl-2癌旁組織

圖1 MEKK3、bcl-2在宮頸癌癌組織及癌旁組織中的表達(免疫組化×200)

2.2 MEKK3與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 MEKK3與宮頸癌患者年齡、組織學類型無關，無統計學差異(P>0.05)；MEKK3與宮頸癌患者FIGO分期、肌層浸潤、淋巴結轉移、分化程度有關，MEKK3在Ⅲ+Ⅳ期、肌層浸潤>1/2、有淋巴結轉移、中-高分化的宮頸癌患者中陽性表達率高于在Ⅰ期、Ⅱ期、肌層浸潤≤1/2、無淋巴結轉移、低分化的宮頸癌患者中陽性表達率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 MEKK3與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 例(%)

2.3 bcl-2與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 bcl-2與宮頸癌患者年齡、組織學類型無關，無統計學差異(P>0.05)；bcl-2與宮頸癌患者FIGO分期、肌層浸潤、淋巴結轉移、分化程度有關，bcl-2在Ⅲ+Ⅳ期、肌層浸潤>1/2、有淋巴結轉移、中-高分化的宮頸癌患者中陽性表達率高于在Ⅰ期、Ⅱ期、肌層浸潤≤1/2、無淋巴結轉移、低分化的宮頸癌患者中陽性表達率，具有統計學差異(P<0.05)。見表3。

表3 bcl-2與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 例(%)

2.4 MEKK3、bcl-2之間的相關性分析 對MEKK3、bcl-2之間進行相關性分析，MEKK3與bcl-2之間呈正相關(r=0.521,P=0.003)。見圖2。

圖2 MEKK3、bcl-2之間的相關性

3 討論

宮頸癌的發生屬于一個多階段、多步驟的較為復雜的過程，與多種分子、基因、信號通路對細胞凋亡的調節作用有關[5]。因此在本文研究中檢測MEKK3在宮頸癌中的表達及其與凋亡抑制基因bcl-2的關系進行分析，以闡明MEKK3與宮頸癌患者凋亡抑制基因bcl-2的關系，為宮頸癌的診治提供新方向。

MEKK3在絲裂原活化蛋白激酶中的胞外調節蛋白激酶通路中發揮著重要的作用，當MEKK3磷酸化胞外調節蛋白激酶通路中的MEK后會激活胞外調節蛋白激酶通路，而MEKK3也可磷酸化激活MKK4對應激活化蛋白激酶通路進行激活[6-8]。有研究表明，MEKK3可以通過作用于IL-1R-TLR通路而介導IL-6的表達，MEKK3在IL-1R-TLR4信號通路中可與TRAF6之間形成復合物，而此時形成的復合物是一種IL-1R、TLR4所誘導產生IL-6的必要復合物[9,10]。MEKK3還可通過IL-1R-TLR通路所介導的IKK-NF-κB信號轉導通路，促進轉錄因子的快速活化，而轉錄因子可作用于多種基因，而對相應的基因的表達進行調控，最終參與惡性腫瘤的發生和發展[11]。目前已經有研究表明，MEKK3參與多種腫瘤的發生，殷憲剛等[12]研究表明MEKK3的異常表達與食管鱗癌的發生、浸潤轉移及預后相關。郭勇峰等[13]研究認為MEKK3參與早期子宮頸癌的發生發展，且與患者的預后相關。在本文研究中檢測宮頸癌癌組織與癌旁組織中MEKK3的陽性表達率，并分析MEKK3與宮頸癌患者臨床病理特征的關系，結果顯示，MEKK3在宮頸癌癌組織中陽性表達率較高，且與患者FIGO分期、肌層浸潤、淋巴結轉移、分化程度有關，此結果說明，MEKK3高表達于宮頸癌中，參與宮頸癌的發生發展。

核轉錄因子會通過調控腫瘤抑制基因的表達而對抑癌基因多介導的細胞凋亡起到抑制作用，此結果提示著核轉錄因子可對抑制凋亡基因起到調控作用[14]。bcl-2屬于一種細胞凋亡抑制基因，最早發現于白血病、淋巴瘤中，臨床上有研究表明，bcl-2通過抗氧化、抑制細胞內Ca+濃度升高以及對細胞核轉運進行封閉等作用抑制細胞的凋亡[15,16]。有研究表明，bcl-2主要在細胞膜的線粒體、粗面內質網上存在，可對細胞的生命周期及逆行延長，并對凋亡刺激因素的耐受性進行增強，最終起到抑制凋亡的作用[17]。另外bcl-2發揮作用是以二聚體的形成，若其形成同聚體后會對細胞凋亡進行抑制。bcl-2的異常的高表達會抑制細胞的凋亡；促使受損細胞獲得永生性，可與生長抑制基因、增殖基因產生協同作用，在上述基因的共同調控下促進腫瘤的發生[18]。目前有多數研究均表明，bcl-2參與多種腫瘤的發生，劉平賢等[19]在其研究中認為bcl-2參與乳腺癌的發生，而陶蕾等[20]認為通過靶向bcl-2會誘導胰島β細胞的凋亡。在本文研究中檢測宮頸癌癌組織與癌旁組織中bcl-2的陽性表達率，并分析bcl-2與宮頸癌患者臨床病理特征的關系，結果顯示，bcl-2在宮頸癌癌組織中陽性表達率較高，且與患者FIGO分期、肌層浸潤、淋巴結轉移、分化程度有關，此結果說明，bcl-2高表達于宮頸癌中，參與宮頸癌的發生發展。

另外本文還對MEKK3、bcl-2之間的相關性進行分析，結果顯示MEKK3與bcl-2之間呈正相關，二者在宮頸癌的發生發展中具有協同作用。

綜上所述，MEKK3在宮頸癌中呈現高表達，且與凋亡抑制基因bcl-2之間具有一定的相關性，兩者在宮頸癌的發生發展中具有協同作用。