濕性年齡相關(guān)性黃斑變性患者血清miR-9和miR-146a表達水平及意義

李紅月

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是由于黃斑區(qū)視網(wǎng)膜因衰老發(fā)生病變的一種慢性病變性疾病，多發(fā)于老年人，是導(dǎo)致老年人眼盲的主要原因之一。流行病學(xué)研究表明，52～64歲老年人發(fā)生AMD的比例約1.5%，75～85歲發(fā)病率則高至27.9%，已成為我國致盲的第三大類疾病[1]。AMD分為干性AMD和濕性AMD，其中濕性AMD(wet AMD，wAMD)臨床多表現(xiàn)為眼底視網(wǎng)膜上皮剝落、發(fā)生纖維化，脈絡(luò)膜出現(xiàn)新生血管等病理變化[2]，然而其發(fā)病機制尚不清楚。有研究表明，病理性血管生成、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等在wAMD疾病發(fā)生中具有重要作用[3]。研究表明，不同種類微小RNAs(Micro RNAs，miRNAs)對以上生物過程分別具有調(diào)控作用，另外隨著分子生物學(xué)的進步，許多miRNA被發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于臨床疾病的診斷和治療[4,5]。因此，本研究通過檢測wAMD患者血清中miR-9、miR-146a表達情況，并分析二者與患者臨床特征、血清炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮生長因子水平的相關(guān)性，旨在揭示血清miR-9、miR-146a表達在wAMD發(fā)生發(fā)展中作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2017年6月在我院眼科診治的wAMD患者87例(105眼)為研究對象(wAMD組)，其中男60例，女27例；年齡50～83歲，平均年齡(65.32±8.95)歲；患者均行眼壓等一般常規(guī)檢查、眼底熒光素血管造影(fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA)、光學(xué)相干斷層掃描成像術(shù)(Optical coherence tomography，OCT)等檢查以明確患者眼睛病變情況，根據(jù)上述檢查結(jié)果，參照wAMD疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)進行診斷[6]。選取同期無眼部疾病體檢者85例為對照組，其中男59例，女26例；年齡50～85歲，平均年齡(65.78±9.71)歲。2組受試者年齡、性別比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)專業(yè)眼科醫(yī)師確診單側(cè)眼或雙側(cè)眼符合wAMD診斷標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)；②年齡50～83歲；③臨床一般資料和病理資料完整；④入院治療前1個月內(nèi)未參加其他臨床項目試驗；⑤明確本研究內(nèi)容并自愿加入本次研究，且依從性良好。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并糖尿病視網(wǎng)膜疾病、黃斑裂孔、高度近視等眼睛底部疾病患者；②眼底病癥不清晰患者；③哺乳和妊娠期患者；④其他可能引起視網(wǎng)膜及黃斑病變的疾病患者；⑤有熒光素鈉針過敏患者；⑥治療前1月內(nèi)患有肝病、高血壓、嚴重炎癥等疾病患者。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料及指標(biāo)采集:采集wAMD患者年齡、性別等，進行眼部常規(guī)檢查、FFA及OCT等檢查，記錄患者眼壓、視網(wǎng)膜下出血情況、眼底熒光素滲透情況及脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)情況。按照CNV形態(tài)分為：①典型性：邊界清晰；②隱匿性：邊界模糊。

1.3.2 血清采集及指標(biāo)檢測:分別于體檢當(dāng)天和入院12 h內(nèi)采集體檢者和wAMD患者肘靜脈血(4 ml/人)，置于抗凝真空管中，分離血清。采用自動酶標(biāo)儀(美國寶特公司)通過人C-反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)酶聯(lián)免疫吸附試劑(武漢艾美捷科技公司)和人血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)酶聯(lián)免疫吸附試劑(武漢華美生物公司)測定各受試者血清中CRP和VEGF水平；以U6作為內(nèi)參，采用實時熒光定量(real-time fluorescence quantitative，qRT)-PCR技術(shù)檢測并分析血清中miR-9、miR-146a相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 2組血清miR-9、miR-146a表達比較 與對照組比較，wAMD患者血清miR-9、miR-146a相對表達量均明顯增高(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清miR-9、miR-146a表達水平比較

2.2 血清miR-9、miR-146a水平與wAMD患者臨床參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡、吸煙、飲酒、病變眼數(shù)及視網(wǎng)膜下出血情況的wAMD患者血清中miR-9、miR-146a表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有眼底熒光滲透的wAMD患者血清中miR-9、miR-146a水平顯著高于無眼底滲透患者(P<0.05)；眼壓>21 mm Hg的wAMD患者血清中miR-9、miR-146a水平顯著高于眼壓為10～21 mm Hg患者(P<0.05)；典型性CNV的wAMD患者血清中miR-9、miR-146a水平顯著高于隱匿性CNV患者(P<0.05)。見表2。

2.3 2組血清VEGF、CRP水平比較 與對照組比較，wAMD患者血清VEGF、CRP水平均明顯增高(P<0.05)。見表3。

2.4 wAMD患者血清miR-9、miR-146a、VEGF、CRP水平的相關(guān)性 Pearson檢驗結(jié)果表明，wAMD患者血清miR-9水平與miR-146a、VEGF水平呈正相關(guān)(P<0.05)、與CRP無明顯相關(guān)(P>0.05)；miR-146a水平與CRP水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與VEGF水平無明顯相關(guān)(P>0.05)；VEGF水平與CRP水平無明顯相關(guān)(P>0.05)。見表4。

2.5 血清miR-9、miR-146a水平診斷wAMD疾病的臨床價值 ROC分析結(jié)果顯示，miR-9對wAMD疾病診斷的AUC為0.634(95%CI：0.495～0.773，P<0.05)，miR-9/U6≥3.67診斷wAMD疾病的敏感性為54.53%，特異性為90.86%；miR-146a對wAMD疾病診斷的AUC為0.774(95%CI：0.662～0.885，P<0.05)，miR-146a/U6≥4.25診斷wAMD疾病的敏感性為69.81%，特異性為77.69%。見圖1。

表2 血清中miR-9、miR-146a水平與wAMD患者臨床參數(shù)關(guān)系

表3 2組血清VEGF、CRP水平比較

表4 wAMD患者血清miR-9、miR-146a、VEGF、CRP水平的相關(guān)性分析

圖1 ROC分析血清miR-9、miR-146a水平診斷wAMD疾病的價值

3 討論

wAMD是一種視網(wǎng)膜色素上皮層代謝障礙導(dǎo)致黃斑部視網(wǎng)膜退行性疾病。隨著生活水平的逐漸提高，我國人口老齡化水平增加，wAMD發(fā)病率隨之逐年增加[7]。因此探究wAMD疾病發(fā)生機制，尋找能反應(yīng)wAMD疾病發(fā)生的生物指標(biāo)對盡早篩查出wAMD患者，以盡早干預(yù)、采取有效治療措施具有重要意義。

miRNAs可通過與靶基因mRNA3’非編碼區(qū)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄表達，參與調(diào)控免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激及血管生成等生物學(xué)過程[8]。miRNA的異常表達在包括AMD等多種疾病中作為重要調(diào)節(jié)因子參與疾病發(fā)生。miRNA分子量小，可通過細胞膜釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，均勻分布在血清或血漿中，相對穩(wěn)定且易于收集和檢測[9]。基于上述特征，血清miRNA可作為診斷疾病的可能生物標(biāo)志物，應(yīng)用前景良好。然而，目前關(guān)于wAMD患者血清miRNA表達模式的研究相對較少。

miR-9是一類哺乳動物常見的miRNA之一，存在于多種細胞、組織中，參與視網(wǎng)膜祖細胞的增殖分化[10]。Liu等[11]研究表明，發(fā)生炎癥的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞中miR-9表達顯著上調(diào)，氫氣治療可顯著下調(diào)miR-9表達，降低LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥，提示miR-9在視網(wǎng)膜炎癥中發(fā)揮作用。Yoon等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-9可能作為治療新血管病理疾病的潛在靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，wAMD患者血清miR-9水平顯著上調(diào)，與Romano等[13]發(fā)現(xiàn)一致，表明miR-9表達上調(diào)可能參與wAMD疾病發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)有眼底熒光滲透、眼壓>21 mm Hg、典型性CNV的wAMD患者血清中miR-9水平顯著高于無眼底熒光滲透、眼壓10～21 mm Hg、隱匿性CNV患者，眼底熒光滲透情況是眼底滲出情況的反映，與疾病嚴重程有關(guān)，表明血清miR-9水平與wAMD疾病嚴重程度有關(guān)。另外，Zhuang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，采用攜帶有miR-146a慢病毒注射糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠，可顯著增加視網(wǎng)膜中miR-146a表達，降低炎性因子表達，改善模型大鼠微血管滲透情況和視網(wǎng)膜功能缺陷，提示miR-146a可能作為治療視網(wǎng)膜病變的潛在靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，wAMD患者血清miR-146a水平顯著上調(diào)，與Pogue等[15]在AMD疾病中發(fā)現(xiàn)一致，表明miR-146a表達上調(diào)可能參與wAMD疾病發(fā)生。進一步研究法發(fā)現(xiàn)血清中miR-146a水平與wAMD患者眼底熒光滲透情況、眼壓、CNV類型有關(guān)，表明血清miR-146a水平與wAMD疾病嚴重程度有關(guān)。

研究表明，脈絡(luò)膜血管異常生長引起CNV發(fā)生，是導(dǎo)致wAMD患者失明的主要因素，其發(fā)生與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達異常相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，wAMD患者血清中VEGF和CRP水平均明顯增高。進一步研究提示wAMD患者血清miR-9水平與VEGF水平正相關(guān)，提示miR-9可能通過調(diào)控VEGF表達，參與調(diào)控視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管生成。Kutty等[17]研究表明，視網(wǎng)膜色素上皮細胞轉(zhuǎn)染miR-146a mimics后，細胞中促炎細胞因子水平明顯增高，提示miR-146a在炎癥引起的視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮調(diào)控作用。Cowan等[18]發(fā)現(xiàn)，采用miR-146a mimics處理人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞，可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路調(diào)節(jié)白介素等炎性因子表達，誘導(dǎo)炎性發(fā)生。以上研究提示，miR-146a可通過調(diào)控炎性反應(yīng)參與視網(wǎng)膜病變過程。本研究結(jié)果顯示，wAMD患者血清miR-146a水平與CRP水平正相關(guān)，提示miR-146a可能通過調(diào)節(jié)CRP表達，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜組織炎性反應(yīng)，參與wAMD疾病發(fā)生。ROC分析發(fā)現(xiàn)，miR-9對wAMD疾病診斷的AUC為0.634，miR-146a對wAMD疾病診斷的AUC為0.774，表明miR-9、miR-146a對健康者和wAMD患者有較強區(qū)分能力。

綜上所述，wAMD患者血清miR-9、miR146a表達上調(diào)，與患者眼底熒光滲透情況、眼壓、CNV類型、CRP水平和VEGF水平有關(guān)，提示血清miR-9、miR146a水平上調(diào)參與wAMD疾病發(fā)生發(fā)展。