核桃青皮提取物調(diào)控IL-6/STAT3抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移的作用研究

高楊 李盛濤 郝文偉

胃癌是我國(guó)第二大惡性腫瘤[1]，我國(guó)胃癌發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率較高、死亡率較高，而且早診斷率低、根治切除率低，放化療和手術(shù)是主要的治療手段[2]。因此尋找有效的藥物治療方法尤為重要。研究表明中醫(yī)藥能夠多靶位、多環(huán)節(jié)抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移[3]，紫杉類藥物是治療胃癌的新高效藥，與其他藥物聯(lián)合治療毒副作用小[2]。用參苓白術(shù)散加減配合治療化療胃癌術(shù)后患者可減輕化療藥物不良反應(yīng)[4]；養(yǎng)正消積膠囊能有效殺死癌細(xì)胞、提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)化療藥物敏感性等多種功能[5]。桃青皮提取物具有很強(qiáng)的抗菌和抗真菌效果[6]；能抑制體外腫瘤細(xì)胞的增殖，直接殺死腫瘤細(xì)胞[7,8]；可明顯抑制Lewis肺癌細(xì)胞的增殖[9]；可抑制Hela細(xì)胞增殖上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)研究核桃青皮提取物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，且分析核桃青皮提取物和IL-6/STAT3之間關(guān)系。為胃癌的預(yù)防和藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)以及新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 胃癌BGC-823細(xì)胞株胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 材料與試劑 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 qPCR SYBR? Green Mix購(gòu)自Takala生物公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)、蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司；細(xì)胞板、酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃青皮提取液制備:參考文獻(xiàn)[8]，核桃青皮用95%的乙醇萃取4次，風(fēng)干得到的微細(xì)粉即為核桃青皮粗提取物。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng):胃癌BGC-823細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，含5% CO2恒溫箱培養(yǎng)。每2～3天傳代一次。

1.3.3 細(xì)胞分組:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BGC-823細(xì)胞分別消化接種于96孔板(5×103個(gè)/孔)培養(yǎng)到細(xì)胞貼壁后換成相應(yīng)濃度的核桃青皮提取物培養(yǎng)液或IL-6，再培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分為核桃青皮提取物0 μg/ml組、核桃青皮提取物10 μg/ml組、核桃青皮提取物20 μg/ml組、核桃青皮提取物40 μg/ml組、核桃青皮提取物80 μg/ml組、對(duì)照組(無核桃青皮提取物)、核桃青皮提取物組(濃度20 μg/ml)、核桃青皮提取物+IL-6組(核桃青皮提取物濃度20 μg/ml、IL-6濃度100 ng/ml)。

1.3.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的核桃青皮提取物0 μg/ml組、核桃青皮提取物10 μg/ml組、核桃青皮提取物20 μg/ml組、核桃青皮提取物40 μg/ml組、核桃青皮提取物80 μg/ml組、對(duì)照組、核桃青皮提取物組、核桃青皮提取物+IL-6組BGC-823細(xì)胞分別消化接種于96孔板(5×103個(gè)/孔)培養(yǎng)48 h后加入20 μl MMT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清，加入150 μl的DMSO，震蕩混勻，在酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值，細(xì)胞增殖抑制率= (空白組A值-處理組A值)/空白組A值×100%。

1.3.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲:參考文獻(xiàn)[11]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)照組、核桃青皮提取物組、核桃青皮提取物+IL-6組BGC-823細(xì)胞分別消化接種于96孔板(5×103個(gè)/孔)培養(yǎng)48 h后，配制不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，饑餓去血清后取適量懸液加入Transwell小室上層(3×105個(gè)/孔)，下室加含有趨化因子的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，再用0.1%的結(jié)晶紫染色，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室上層加入基質(zhì)膠Matrigel，凝固后接種BGC-823細(xì)胞，之后和細(xì)胞遷移操作相同。顯鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞的觀察、計(jì)數(shù)。

1.3.6 qRT-PCR分析 MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平:按照Trizol說明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照 qPCR SYBR? Green Mix說明書進(jìn)行qRT-PCR方法擴(kuò)增。循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.7 蛋白免疫印跡(western blot，WB)檢測(cè)蛋白表達(dá):收集穩(wěn)定表達(dá)對(duì)照組、核桃青皮提取物組的BGC-823細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白總量。各組蛋白上樣量60 μg，SDS-PAGE后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入各自的一抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入相對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h。PBS洗滌3次，每次10 min，然后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片進(jìn)行拍照分析，測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和 β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度核桃青皮提取物處理胃癌BGC-823細(xì)胞后，48 h時(shí)胃癌BGC-823細(xì)胞的抑制率隨著核桃青皮提取物的濃度升高而逐漸顯著升高(P< 0.05)?？梢?，核桃青皮提取物可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞增殖。見表1。

表1 不同濃度核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響

2.2 核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞遷移侵襲的影響 Transwell 法檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，核桃青皮提取物組胃癌BGC-823細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P< 0.05)。可見，核桃青皮提取物可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞遷移和侵襲。見圖1，表2。

圖1 核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞遷移(A)侵襲(B)的影響(結(jié)晶紫染色×400)

表2 核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞遷移侵襲的影響 n=3,個(gè),

2.3 核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)基因表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，核桃青皮提取物組胃癌BGC-823細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)基因MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P< 0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，核桃青皮提取物組胃癌BGC-823細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)基因MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P< 0.05)?？梢?，核桃青皮提取物抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)。見圖2，表3。

圖2 MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

表3 核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響n=3,個(gè),

2.4 核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞中IL-6/STAT3表達(dá)的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，核桃青皮提取物組胃癌BGC-823細(xì)胞中IL-6和p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P< 0.05)。可見，核桃青皮提取物抑制IL-6和p-STAT3的表達(dá)。見圖3，表4。

圖3 IL-6、p-STAT3蛋白表達(dá)

表4 核桃青皮提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞中IL-6/STAT3表達(dá)的影響n=3,個(gè),

2.5 IL-6刺激后逆轉(zhuǎn)了核桃青皮提取物對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 MTT法和Transwell 法檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，核桃青皮提取物組胃癌BGC-823細(xì)胞抑制率顯著升高；細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P< 0.05)。相較于核桃青皮提取物組，核桃青皮提取物+IL-6組胃癌BGC-823細(xì)胞抑制率顯著降低；細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P< 0.05)?？梢?，IL-6刺激后逆轉(zhuǎn)了核桃青皮提取物對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。見圖4，表5。

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人們身心健康，中醫(yī)藥療法是其常用的治療手段[12]。中西醫(yī)結(jié)合治療將是一個(gè)必然的發(fā)展方向[13]。核桃青皮富含胡桃醌、多酚、黃酮、色素、多糖等多種生物活性成分，具有殺菌消炎、抗腫瘤等作用[14]。研究表明，胡桃醌可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及引起細(xì)胞G2/M期阻滯，抗腫瘤效果好[15]。核桃青皮提取物對(duì)多種癌癥都有一定抑制作用，或直接作用細(xì)胞，或阻礙細(xì)胞周期，或抑制PI3K/Akt信號(hào)通路等。其主要成份胡桃醌直接殺傷人肝癌腫瘤細(xì)胞[16]；青龍衣多糖在體外直接殺傷人結(jié)腸癌細(xì)胞，但體內(nèi)其抗腫瘤機(jī)制或與PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)[17]。核桃青皮粗提物阻滯食管癌細(xì)胞G0/G1期[18]；核桃青皮粗提物抑制小鼠肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[19]；復(fù)方青龍衣膠囊使胃癌細(xì)胞停滯在G1/S期達(dá)到抗腫瘤作用[20]。反左金丸水提物對(duì)胃癌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用并可誘導(dǎo)其凋亡[21]；青龍衣含藥血清抑制胃癌細(xì)胞的增殖[22]。白藜蘆醇能通過下調(diào)由IL6引起的p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[23]。辛溫通陽中藥蔥白[24]、桂枝提取物[25]等多種提取物均可以影響IL-6/STAT3信號(hào)通路中相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，具有防治AS的作用。薏苡仁提取物能有效抑制C57小鼠肝癌模型的腫瘤生長(zhǎng)，能降低血清IL-6水平[26]。

圖4 IL-6刺激后逆轉(zhuǎn)了核桃青皮提取物對(duì)BGC-823細(xì)胞遷移(A)、侵襲(B)的抑制作用(結(jié)晶紫染色×400)

表5 IL-6刺激后逆轉(zhuǎn)了核桃青皮提取物對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 n=3,個(gè),

IL-6是一類由細(xì)胞產(chǎn)生又在細(xì)胞間作用的細(xì)胞因子[27]，在腫瘤的形成過程中有重要作用，能誘導(dǎo)STAT3活化，激活I(lǐng)L- 6/ STAT3信號(hào)通路[28,29]。IL-6介導(dǎo)的信號(hào)通路與乳腺癌[30]、肝癌[31]、胃癌[32]、卵巢癌[33]、結(jié)直腸癌[34]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在放射性肺炎患者、胃癌患者中表達(dá)較高[35,36]；是非小細(xì)胞肺癌中關(guān)鍵的促腫瘤細(xì)胞因子[37]。PRL-3能通過IL-6上調(diào)p-AKT和p-STAT3促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移[38]。其在癌癥中的重要作用或可作為癌癥預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)[23]。

STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子中的一種，參與多種因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中非常重要，是關(guān)鍵致癌基因和重要腫瘤靶點(diǎn)之一[39]。STAT3與胃癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、治療和預(yù)后密切相關(guān)[40]。研究發(fā)現(xiàn)STAT3在胃癌細(xì)胞[41]、非小細(xì)胞肺癌[42]中高表達(dá)，說明STAT3與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)STAT3的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[43]；p-STAT3在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)明顯升高[44]。在胃癌的治療上，高度激活STAT3會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[45]；阻斷STAT3，可抑制AGS細(xì)胞[46]、人胰腺癌細(xì)胞[47]的生長(zhǎng)增殖。異常高表達(dá)的磷酸化STAT3會(huì)導(dǎo)致膀胱腫瘤惡性進(jìn)展[48]。Chatterjee等[49]研究發(fā)現(xiàn)STAT3的核表達(dá)與胃癌患者存活呈負(fù)相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮提取物處理后，胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲顯著降低，且遷移侵襲相關(guān)基因MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低，IL-6、p-STAT3蛋白的表達(dá)水平顯著降低。在核桃青皮提取物處理的基礎(chǔ)上添加IL-6后，胃癌細(xì)胞的抑制率顯著降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高。

綜上所述，核桃青皮提取物抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移，IL-6刺激后逆轉(zhuǎn)了核桃青皮提取物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)控IL-6/STAT3的表達(dá)有關(guān)。可為胃癌的預(yù)防和治療提供新的研究思路和理論依據(jù)。