高效液相色譜法測定人血漿中雷尼替丁的濃度及其方法學研究

董甲慶，范麗，李凱旋，陳玉林

西安醫學院第二附屬醫院藥劑科1、消化科2、檢驗科3、營養科4，陜西 西安 710038

目前臨床用于治療潰瘍的藥物應用最廣泛的是雷尼替丁。該藥具有速效和長效的特點，對胃及十二指腸潰瘍的療效很高，能有效抑制各類刺激引起的胃酸分泌及基礎胃酸分泌，是一種強效組胺H2受體拮抗劑，阻斷組胺與胃黏膜壁細胞上的H2受體結合，降低胃酶的活性，同時抑制胃蛋白酶的分泌，但對胃泌素及性激素的分泌不產生影響[1]。主要用于胃及十二指腸潰瘍、反流性食管炎、手術后潰瘍、胃泌素瘤及其它胃酸分泌性疾病的治療，也可用于預防應激性潰瘍。

近年來研究發現，雷尼替丁聯合其他藥物在治療幽門螺桿菌陽性的十二指腸潰瘍、蕁麻疹和腦出血后應激性潰瘍等方面效果明顯要優于其他同類藥物。其作用迅速、藥效良好、價格低廉的優勢使得雷尼替丁在臨床上使用廣泛[2]。

雷尼替丁口服吸收效果不受食物和抗酸藥的影響，存在首過效應，生物利用度為50%。單次口服雷尼替丁0.15 g后1～3 h達峰，峰濃度(Cmax)為400～500 ng/mL，表觀分布容積約為1.9 L/kg，作用可維持8～12 h，血漿蛋白結合率約為15%。在體內分布廣泛，能透過血-腦屏障。其半衰期為2～3 h，腎功能不全時，半衰期會相應延長。大部分以原型藥形式經腎排泄，腎臟清除率為7.2 mL/(kg·min)，30%經肝內代謝轉化為S-氧化物、N-氧化物和去甲基雷尼替丁。

雷尼替丁臨床常見不良反應有頭暈、頭痛、惡心、乏力、皮疹、便秘等；少數患者服藥后有肝功能輕度損傷現象，停藥后癥狀即消失。其對中樞神經、性腺功能和腎功能不良反應較輕微。

目前關于血漿中雷尼替丁的測定方法有液相色譜串聯質譜(LC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、微透析一毛細管電泳聯用技術等[3-9]。HPLC因其方法簡單，相比于LC-MS其儀器要求低，方便操作，在定量分析方面足以滿足生物樣品分析要求，因此本研究擬采用標準曲線、最低定量限、回收率、批間和批內精密度、穩定性等參數對HPLC法檢測血漿中雷尼替丁濃度的準確性及可靠性進行方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100)；紫外檢測器(G1314A VWD)；MILLIPORE超純水機(美國MILLIPORE公司)；5804R高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；XS105DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。鹽酸雷尼替丁標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號100163-201006)；甲硝唑標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號100191-200606)；色譜純為甲醇，其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件及樣品處理

1.2.1 分析方法及色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 m)；流動相：甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液-三乙胺(12.5：87.5：0.06，V/V/V)；檢測波長：320 nm；流速為1.2 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：30 L；內標：10μg/mL甲硝唑。

1.2.2 血漿樣品處理 吸取血漿樣品200μL，加入甲硝唑20μL，10μg/mL混勻，再加入10%高氯酸100 μL，渦旋振蕩1 min，然后14 000 r/min離心5 min，取上層清液150μL轉移至進樣瓶進樣，30 L分析。

1.3 方法學驗證

1.3.1 儲備液制備 精密稱取鹽酸雷尼替丁標準品11.16 mg(約相當于雷尼替丁10.00 mg)，用甲醇/水(50/50)定容至10 mL，即得雷尼替丁標準儲備液(1 mg/mL)，置于4℃冰箱儲存備用。精密稱取甲硝唑標準品5 mg，用甲醇/水(50/50)定容至10 mL，即得甲硝唑標準儲備液(0.5 mg/mL)，置于4℃冰箱儲存備用。

1.3.2 專屬性實驗 專屬性是指生物樣品中存在的其他成分在分析檢測過程中不干擾樣品的檢測，能夠準確、專一的檢測樣品。本試驗收集了6個不同來源的血漿對雷尼替丁是否存在干擾進行檢測，結果發現在本試驗條件下，雷尼替丁和內標甲硝唑相互無干擾，6個不同來源的血漿中雜質不干擾樣品峰，測定條件下雷尼替丁和內標的保留時間分別約為9.363 min和10.79 min，說明該方法專屬性較高。在此條件下所測得的結果能代表待測成分濃度。

1.4 統計學方法 應用SPSS24.0軟件進行統計學分析，測定的血藥濃度以均數±標準差(x-±s)表示，采用DAS3.2.6軟件非房室模型法計算藥代動力學參數，繪制色譜曲線圖。

2 結果

2.1 血漿中雷尼替丁標準工作曲線 標準曲線反映的是所測定樣品濃度與儀器響應值之間的關系，一般用回歸方程及相關系數來評價線性關系，標準曲線高低濃度范圍為定量范圍。本試驗標準曲線：精密吸取雷尼替丁標準儲備液制成系列標準工作液：25 000 ng/mL、20 000 ng/mL、10 000 ng/mL、5 000 ng/mL、2 000 ng/mL、1 000 ng/mL、500 ng/mL，分別吸取工作液20μL，加空白人血漿180μL使其中雷尼替丁濃度為2 500 ng/mL、2 000 ng/mL、1 000 ng/mL、500 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL的血漿標準品。按“血漿樣品處理”項下處理后，在“分析方法及色譜條件”下，以血漿中雷尼替丁的濃度值為橫坐標，待測化合物與內標化合物峰面積比(Area Ratio)為縱坐標，檢測標準曲線中各濃度點的樣本，記錄樣品峰面積，作直線回歸(加權系數為Quadratic(Amnt))，得到雷尼替丁回歸方程為：y=1.374 802 92x+0.007 277 1(r=0.998 80)，見表1。

表1 標準曲線中雷尼替丁與內標峰面積比值與濃度

2.2 最低定量限實驗 定量下限表示測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度，是指標準曲線上的最低濃度點，即LLOQ。應滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/10～1/20時的藥物濃度。實驗中取180μL空白人血漿，加入雷尼替丁(500 ng/mL)標準工作液20μL，使雷尼替丁濃度為50 ng/mL，按“血漿樣品處理”進行操作，記錄樣品與內標峰面積，計算兩者比值，依照標準工作曲線計算相應的藥物濃度，以此為最低定量限(LLOQ)指標。結果見表2及圖1。

表2 雷尼替丁的血漿最低定量限試驗(n=5)

圖1最低定量限色譜圖

2.3 精密度和準確度實驗 精密度是指在確定的分析條件下，相同介質中濃度樣品的一系列測量值的分散程度。通常用質控樣品的批間和批內RSD來考察方法的精密度。準確度是指在確定的分析條件下，測得的生物樣品濃度與真實濃度的接近程度(即質控樣品的實測濃度與真是濃度的偏差)，重復測定已知濃度分析物樣品可獲得準確度。首先精密吸取雷尼替丁標準儲備液制成系列標準工作液：1 000 ng/mL、5 000 ng/mL、20 000 ng/mL，分別精密吸取工作液20μL加入空白人血漿180μL，使其中雷尼替丁的濃度為100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血漿標準品。按“血漿樣品處理”項下操作，記錄樣品與內標峰面積，計算兩者比值，代入同一條標準工作曲線計算相應的藥物濃度，以此為批間和批內變異指標。測得血漿中批內變異和3個分析批的批間變異，見表3、表4。

2.4 回收率測定 分析物的提取回收率是以生物樣本基質中回收得到分析物質的響應值除以純標準品產生的響應值，檢測高中低三個濃度的提取回收率，其結果應當精密和可重現。按要求測定低、中、高(100 ng/mL、500 ng/mL、2000 ng/mL)3個濃度的質控血漿樣品各5份，按上述“血漿樣品處理”方法處理后，得到樣品峰面積A1，同時用流動相稀釋配制成與血漿質控樣品理論進樣溶液相同濃度的溶液進樣分析，得到樣品峰面積A2；以A1/A2的比值求算雷尼替丁的絕對回收率，見表5。

表3 雷尼替丁的血漿方法學批內精密度試驗(n=5)

表4 雷尼替丁的血漿方法學批間精密度試驗(n=15)

表5 血漿中雷尼替丁絕對回收率

2.5 穩定性試驗 樣品穩定性應根據不同存放條件即在室溫、冰凍或凍融條件下進行穩定性檢測，以確定生物樣品的存放條件及時間。

2.5.1 血漿凍融穩定性 取180μL空白人血漿，加入不同濃度的雷尼替丁標準液20μL，使其中雷尼替丁的濃度為100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血漿標準品，放置-40℃冰箱保存，待凍結后室溫解凍，如此重復3次后測定血漿中藥物濃度，見表6。

2.5.2 血漿樣品8 h放置穩定性 取180μL空白人血漿，加入不同濃度的雷尼替丁標準液20μL，使其中雷尼替丁的濃度均為100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血漿標準品，室溫放置8 h后測定血漿中藥物濃度，見表7。

2.5.3 血漿樣品處理后24 h放置穩定性考察 取180μL空白人血漿，加入不同濃度雷尼替丁標準工作液20μL，使其中雷尼替丁的濃度為100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血漿標準品，按“血漿樣品處理”進行操作，將樣品在自動進樣器(室溫)中放置24 h后進行分析檢測，見表8。

表6 雷尼替丁的血漿樣品凍融穩定性考察試驗(n=5)

表7 血漿樣品室溫8 h放置雷尼替丁的穩定性考察試驗(n=5)

表8 雷尼替丁血漿處理樣品自動進樣器內24 h放置穩定性考察試驗(n=5)

3 討論

本文使用方法學的標準曲線、最低定量限、回收率、批間和批內精密度、穩定性等指標對高效液相色譜法測定血漿中雷尼替丁濃度的準確性進行驗證。發現6個不同來源的血漿中雜質不干擾樣品峰，而測定條件下雷尼替丁和內標的保留時間分別約為9.4 min和10.8 min，說明該方法專屬性較高，在此條件下所測得的結果能代表待測成分濃度。使用雷尼替丁標準溶液和空白血漿制備不同濃度的血漿保準品，得出血漿雷尼替丁濃度標準曲線y=1.374 802 92x+0.007 277 1(r=0.998 80)。由標準曲線計算得到雷尼替丁的血漿最低定量限為50 ng/mL。接著由高中低三個濃度質控血漿樣樣品峰面積與用流動相稀釋配制成與血漿質控樣品峰面積的比值，計算得到雷尼替丁的絕對回收率為90.2%～94.1%。對高中低三個濃度批間和批內精密度測定試驗結果，雷尼替丁的日間和日內RSD均小于10%，可證明HPLC測定雷尼替丁濃度準確可靠。血漿樣品的凍融穩定性、8 h室溫放置穩定性、血漿處理樣品24 h放置穩定性試驗均未見雷尼替丁樣品發生明顯降解，符合生物樣品的分析要求。

通過對HPLC測定血漿中雷尼替丁濃度的方法學驗證，可以得出本文中所建立的方法學科學可靠，能夠準確測定雷尼替丁濃度的結論。