白介素-17、轉化生長因子-β1在煙霧暴露大鼠肺組織中的表達及與肺血管重塑的關系

熊瑋 曾玉蘭 周薇

有研究表明,COPD早期階段病人和沒有氣流受限的吸煙者均可發生肺血管改變[1]。肺血管重塑過程分子機制復雜，其中TGF-β1在血管張力和增殖的控制上扮演著重要角色[2]。Th17細胞是一種擁有獨立分化機制的新型 CD4+效應 T 細胞，在COPD、哮喘等慢性炎癥性疾病和多種自身免疫性疾病中均有重要作用。IL-17是 Th17 細胞的主要效應因子。已有研究證明，低壓低氧可致Th17細胞在肺組織中增多，在肺血管與心肌結構重塑中發揮重要作用[3]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)和IL-6共同作用，誘導了Th17細胞的分化。Smads蛋白家族參與TGF-β1的細胞內信號轉導，其中Smad2/3是TGF-β通路信號下傳的第一個信號分子。本研究通過建立香煙煙霧暴露大鼠模型進行觀察，并進一步加入藥物干預，以期探討IL-17、TGF-β1及TGF-β/Smad通路在肺血管重塑中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級健康雄性 7周齡SD大鼠72只，體質量(210±10)g(由華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院老年醫學研究所動物實驗室飼養);CY-100B 數字測氧儀，兔抗 TLR-4 多克隆抗體、小鼠抗PCNA 單克隆抗體、PV600免疫試劑盒(武漢谷歌生物公司);奧林巴斯光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司);HMIAS-2000 彩色圖文分析系統(武漢千屏影像公司)。

1.2 實驗模型制備及動物分組 參照文獻[4]制備大鼠被動吸煙裝置，煙熏箱大小為 100 cm×65 cm×45 cm，每側各留9個直徑2.5 cm的通氣孔。大鼠適應性喂養7 d無異常后隨機分為對照組(S1組)、煙霧暴露組(S2組)、煙霧暴露+藥物干預組(S3組)，每組各 24只。S1組大鼠置于小鐵籠內，自由呼吸空氣，除常規喂養外不做其他處理；S2、S3組大鼠在規定煙霧暴露時間內放置于煙熏箱內，每次使用10支香煙捆扎為一組后點燃并置于煙熏箱中的支架上，香煙采用武漢市售紅金龍牌香煙，每支焦油含量為15 mg。用 CY-100B數字測氧儀進行監測，煙熏箱中的氧濃度保持在 20%～21%之間，根據監測結果開放煙熏箱的通氣孔；大鼠每天煙霧暴露2次，每次30 min，2次暴露時間間隔4 h。香煙煙霧暴露間隔期間將大鼠置于正常無煙環境中飼養，任其自由活動、飲食。同時，S3組大鼠于第5周起每次煙熏后腹腔注射Smad3抑制劑SB431542，2次/d，直至第12周。Smad3抑制劑(SB431542)以二甲基亞砜(DMSO)溶解，使用前將SB431542溶解在2%DMSO+30%聚乙二醇300+雙蒸水中，濃度為5 mg/mL，每次使用劑量為5 mg/kg，2次/d。如出現死亡則終止實驗。S1、S2、S3組分別于第8周、第12周隨機處死12只大鼠。

1.3 病理標本制作 各組大鼠到達造模時間干預點后，用1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)進行麻醉，眼球取血法取血，制備血清。放血處死后開胸，分離出肺臟，取左肺用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，行石蠟包埋，病理切片機切片，切片厚度約4μm。

1.4 肺血管蘇木精-伊紅(HE)染色及病理學觀察 病理切片用HE染色法染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡和肺血管的病理學情況，每張切片隨機選取結構較完整、橫斷面較圓且直徑約為50～200μm 的肺動脈 5 支，分別測量內外徑、血管面積及管壁厚度，以圖文分析儀測量并記錄管壁面積/血管總面積(vascular wall area/total vascular area，WA%)和血管壁厚度/血管外徑(vascularwall thickness/vascular external diameter，WT%)。

1.5 IL-17檢測 采用免疫組化法檢測大鼠肺組織中IL-17表達水平，ELISA法測定血清中 IL-17 的含量。IL-17免疫組化試劑盒均由美國 Santa Cruz 公司生產。IL-17一抗為山羊抗大鼠 IL-17 單克隆抗體，1∶70稀釋。陰性對照均用PBS代替。染色步驟按說明書進行。以顯微鏡400倍視野下，隨機5個視野陽性染色積分光密度(IOD)均值反映IL-17表達量。

1.6 Smad3檢測 采用免疫組化法檢測肺組織中Smad3的表達水平，用鏈霉親和素過氧化物酶 (SP)法進行。微波加熱法修復抗原，DAB顯色。試劑盒購自博士德生物制品有限公司，Smad3抗體濃度為1∶200。以5個視野IOD均值反映Smad3表達量。

1.7 TGF-β1檢測 采用PV6000二步法免疫組化染色法檢測肺動脈組織TGF-β1的表達水平，按照試劑盒說明書進行操作，每張切片在 400 倍視野下隨機采集5條直徑100～200μm的動脈，采集圖像，測定每個視野下陽性染色動脈的吸光度(A)，進行定量分析。

2 結果

2.1 動物的一般情況 實驗開始前，各組動物活動、飲食情況良好，活動敏捷。在整個實驗過程中未見死亡小鼠。實驗動物每日給予充足定量飼料，觀察每日飼料剩余量。與S1組比較，8 周及12周時，S2動物活動度明顯下降，反應遲鈍、飲食量下降；S3組活動度下降，反應遲鈍，飲食量下降，但較S2組程度減輕。

2.2 HE染色觀察肺組織的病理形態學改變 對照組肺動脈壁較薄，結構正常。S2組及S3組隨煙霧暴露時間延長，氣道和血管周圍炎性細胞浸潤逐漸加重，肺血管壁逐漸增厚。但未見肺氣腫改變。見圖1。

肺血管重塑定量分析觀察指標：S1組8周與12周的WA%和WT%值無明顯差異。S2組8周和12周的WT%、WA%值均較同期S1組顯著增加，S2組12周時肺動脈壁厚度明顯大于8周時，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。S3組8周及12周時的WA%和 WT%值分別高于同期S1組，但低于同期S2組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

A：S1組8周時；B：S1組12周時；C：S2組8周時；D：S2組12周時；E：S3組8周時；F：S3組12周時 圖1 各組大鼠肺組織病理形態學改變(HE染色，×200)

2.3 各組小鼠肺動脈組織TGF-β1的表達水平比較 S1組8周及12周時肺動脈無 TGF-β1 陽性染色，S2組8周及12周時肺動脈平滑肌細胞胞漿 TGF-β1強陽性染色。S3組8周及12周時肺動脈平滑肌細胞胞漿 TGF-β1強陽性染色。見圖2。S2組8周、12周時，TGF-β1蛋白相對表達量均較同期S1組顯著增加(P<0.05)，且12周時明顯高于8周亞組(P<0.05)。S3組8周及12周時TGF-β1蛋白相對表達亦明顯高于同期S1組(P<0.05)，但與同期S2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4 肺組織IL-17、Smad3表達水平比較 S2組肺組織IL-17、Smad3表達水平隨煙霧暴露時間延長而增加，且較同期S1組增加，差異均具有統計學意義(P<0.05)。S3組8周及12周時，肺組織IL-17、Smad3表達較同期S2組減少，但較同期S1組增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

A：S1組8周時；B：S1組12周時；C：S2組8周時；D：S2組12周時；E：S3組8周時；F：S3組12周時 圖2 免疫組化法檢測肺動脈組織TGF-β1的表達水平(DAB 顯色，×200)

2.5 血清中 IL-17 的水平比較 S2組血清IL-17水平隨煙霧暴露時間延長表達增加，且較同期S1組增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。S3組8周及12周時，血清IL-17水平高于同期S1組(P<0.05)，但低于同期S2組(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺血管重塑指標及免疫組化檢測指標比較

2.6 TGF-β1與WA%、WT%及肺組織IL-17、Smad3的相關性分析 肺動脈中TGF-β1表達水平與WA%、WT%(r=0.797、0.901，P<0.01)以及肺組織IL-17、Smad3(r=0.479、0.891，P<0.01)表達水平均呈正相關。

3 討論

肺血管重塑是肺動脈內膜、中膜和外膜共同增厚的過程。香煙煙霧可以直接作用于肺血管，在未發生缺氧、肺功能下降和肺血管床損毀的情況下，即可引起肺血管重塑，但具體機制尚不完全明確。

龍翔等[5]研究發現，吸煙的COPD病人及吸煙的肺功能正常人群肺組織中的IL-17信使RNA 的相對表達量及 IL-17細胞因子均較未吸煙者增高。在對低壓低氧復制缺氧性肺動脈高壓(PAH)大鼠的研究中發現，低壓低氧后，大鼠肺組織及血清中IL-17表達水平增高，分析認為低壓低氧后，Th17細胞在肺組織中增多，導致肺組織 IL-17水平增高，IL-17可以刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞表達內皮細胞黏附分子1等黏附分子，并能增強血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等生長因子的促增殖作用，共同參與肺血管重塑[3]。IL-17能募集及活化中性粒細胞，促進T細胞活化及刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生細胞因子，從而介導組織炎癥反應，促進新生血管的生成[6]。IL-17是 Th17 細胞的主要效應因子。Th17細胞的分化需要TGF-β信號的參與。

TGF-β1具有重要的免疫調節和致纖維化活性，故而在氣道炎癥及氣道重塑中占重要地位[7]。其存在于所有的哺乳動物中，上皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、單核細胞、巨噬細胞等細胞都能夠合成并釋放TGF-β1。研究表明，在炎癥反應明顯的COPD大鼠中,其肺小動脈的內皮細胞和平滑肌細胞TGF-β1表達增高[2]。吸煙也可以導致大鼠氣道上皮細胞 TGF-β1表達明顯升高，而且香煙煙霧刺激時間越長，TGF-β1表達越多[8]。

本實驗通過建立煙霧暴露大鼠肺血管重塑模型，經HE染色觀察到煙霧暴露后各組大鼠肺血管都發生了不同程度的炎癥浸潤及管壁變形、增厚，管腔狹窄等，其中以吸煙 12周的小鼠血管的改變最為明顯。通過計算血管重塑的客觀指標(WA%和WT%)，證實肺血管重塑隨煙霧暴露時間延長而逐漸加重，肺血管重塑程度與煙霧暴露時間呈正比。而隨煙霧暴露時間延長，大鼠肺組織及血清中IL-17表達亦增高，肺組織中Smad3表達增加，與肺動脈組織中TGF-β1表達呈正相關；肺動脈組織中TGF-β1表達增高，與肺血管重塑水平呈正相關。表明IL-17、Smad3、TGF-β1在肺血管重塑中起重要作用。在一項對COPD病人的研究中同樣發現，COPD病人的血清、肺泡灌洗液中IL-17的含量均明顯增高，表明IL-17可能在COPD的病理進程中發揮重要的作用[9]。加入Smad3抑制劑進行干預后，肺血管組織中TGF-β1未明顯減少，但血清IL-17及肺組織中IL-17明顯減少，肺血管重塑程度較同期S2組減輕，表明在IL-17、TGF-β1參與的肺血管重塑過程中，TGF-β/Smad3通路起重要作用。

TGF-β發揮生物學效應主要依賴于其下游高度保守的胞內信號蛋白-Smads蛋白家族介導的信號傳遞,TGF-β通過激活其受體的Smad2和Smad3，聯合核轉錄因子來調控基因轉錄。作為TGF-β1的下游信號，Smad3是參與 COPD發病的關鍵性細胞因子。野百合堿PAH模型大鼠肺動脈中，TGF-β1、磷酸化Smad3 蛋白表達明顯升高，Smad3 磷酸化水平顯著增高，證實在PAH大鼠肺動脈中TGF-β/Smad3信號通路呈顯著活化狀態，參與大鼠PAH的發生發展過程[10]。SB431542為特異性ALK5抑制劑，即TGF-β受體Ⅰ的抑制劑，可以抑制ALK5激活對下游信號分子Smad2/3的磷酸化，從而阻斷依賴Smad 途徑。本次實驗表明，使用SB431542能減少IL-17表達，減輕肺血管重塑程度。但肺血管重塑發病機制復雜，可能有多種信號通路參與其中，Smad信號通路是其中途徑之一。在肺纖維化發病機制中，TGF-β1 還可能誘導非Smad信號通路。

綜上所述，煙霧暴露大鼠肺組織中IL-17、肺血管組織中TGF-β1表達明顯增高，通過多種途徑參與肺血管重塑過程，其中Smad3在促進IL-17表達及肺血管重塑中起重要作用，SB431542通過阻斷TGF-β/Smad通路可能減輕肺血管重塑程度，可能為今后COPD、肺血管疾病的治療提供方向。但本研究未對SB431542的使用劑量進一步探討，使用抑制劑的不良反應需長期觀察。而且IL-17參與肺血管重塑可能存在多種途徑，仍需進一步研究。