肺痹湯2號(hào)對(duì)二氧化硫染毒小鼠肺損傷的干預(yù)研究

劉艷芳 牛潔 吳志松 劉浩歌 焦揚(yáng)

隨著全球工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，大氣污染日益嚴(yán)重。二氧化硫(SO2)是大氣中最常見(jiàn)的污染物之一，研究表明[1-2]，大氣SO2污染可增加呼吸系統(tǒng)發(fā)病率和死亡率。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)SO2的毒理作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)建立吸入SO2染毒的動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，SO2進(jìn)入呼吸系統(tǒng)后可以造成肺組織損傷，引發(fā)肺組織炎癥反應(yīng)[3]。應(yīng)用中醫(yī)藥可以干預(yù)炎性損傷過(guò)程，中醫(yī)藥對(duì)SO2損傷是否有預(yù)防或治療的作用，目前這方面的研究寥寥無(wú)幾。本課題組以中醫(yī)學(xué)理論對(duì)SO2等細(xì)顆粒物污染加以分析，認(rèn)為它不同于傳統(tǒng)中醫(yī)理論的六淫邪氣、疫癘之邪，是一種新型的外來(lái)毒邪，存在于無(wú)法控制的環(huán)境空氣中，與呼吸之氣同在，活的生物體不可避免要吸入，因而危害范圍廣，預(yù)防、治療難度大。對(duì)機(jī)體的損害具有不確定性，潛伏期長(zhǎng)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察肺痹湯2號(hào)對(duì)SO2染毒小鼠肺損傷炎癥因子的干預(yù)作用，探索了中藥影響SO2染毒小鼠肺損傷的部分機(jī)制，從而為SO2污染的防治提供理論基礎(chǔ)，為研發(fā)防治SO2肺損傷的純中藥制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性ICR小鼠48只，體重(20±2)g。小鼠購(gòu)買(mǎi)于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：11400700059072)，寄養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物房，自由進(jìn)食和飲水，觀察檢疫、適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，稱重，隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組、模型組、中藥預(yù)防組、中藥治療組，每組12只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器 小鼠染毒箱 (PSU材質(zhì)，規(guī)格330 mm×215 mm×200 mm，北京丹瑞林科技發(fā)展有限公司)，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，Thermo，USA)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特)，恒溫振蕩搖床(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)，高速冷凍離心機(jī)(Hettich德國(guó))，紫外分光光度計(jì)(上海尤尼柯公司UV-2000)，熒光定量PCR儀(ABI7500)，電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠試管)，凝膠成像儀(Tanon-6600 天能公司)，分光光度計(jì)(UV-2000，上海尤尼柯公司)，微量移液器等。

1.1.3 主要藥品及試劑 肺痹湯2號(hào)方顆粒：由生黃芪、紅景天、金銀花、黃芩、丹參、生甘草組成，劑量比例為1.5∶1.5∶1.5∶1∶1∶1。使用北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供的中藥配方顆粒進(jìn)行本研究。染毒氣體：高壓液化SO2，純度99.99%，由北京海普科技有限公司提供。10%甲醛、蘇木素精、一氧化汞、硫酸鋁鉀、無(wú)水乙醇、蒸餾水、5%冰乙酸、伊紅、95%乙醇、蒸餾水、鹽酸、酒精、中性樹(shù)膠、二甲苯。白介素-6 (interleukin-6，IL-6)測(cè)定試劑盒、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green PCR Mixture、Dnase 1均由康為世紀(jì)生物科技有限公司提供。

1.2 造模、給藥及取材方法

1.2.1 染毒時(shí)間 對(duì)模型組、中藥治療組、中藥預(yù)防組的小鼠進(jìn)行SO2靜式吸入染毒處理。吸入時(shí)間：每日上午8點(diǎn)～12點(diǎn)，連續(xù)吸入4小時(shí)，連續(xù)21天，空白對(duì)照組同時(shí)吸入過(guò)濾后的新鮮空氣。SO2吸入染毒時(shí)小鼠禁食禁水，其余時(shí)間小鼠自由進(jìn)食飲水。

1.2.2 染毒方法 本實(shí)驗(yàn)中采取靜式染毒的方式，SO2濃度：(28±2)mg/m3。將小鼠分組置于小鼠染毒箱(330×215×200 mm)中，染毒箱除進(jìn)氣孔外其他部位均為密封狀態(tài)。根據(jù)染毒箱大小計(jì)算出所需99.99%SO2的體積，通過(guò)針管抽取相應(yīng)體積的99.99%，經(jīng)進(jìn)氣孔打入染毒箱后，迅速密封住進(jìn)氣孔，待SO2在染毒箱中擴(kuò)散一段時(shí)間后再開(kāi)啟進(jìn)氣孔。通過(guò)泵吸式SO2檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)染毒箱中SO2濃度，使SO2濃度保持在(28±2)mg/m3范圍內(nèi)。熏氣染毒結(jié)束后，在出氣孔處連接一負(fù)壓吸引器，負(fù)壓吸引器的另一頭通向飽和碳酸氫鈉溶液，以回收SO2氣體，以免造成實(shí)驗(yàn)室空氣污染。

1.2.3 給藥方法 按照人與小鼠體表面積進(jìn)行換算，給藥劑量是成人臨床劑量的等效劑量。中藥治療組自染毒處理后一周，既第8天起開(kāi)始予肺痹湯2號(hào)方溶液10 mL/kg·bw灌胃，至第21天止，共灌胃14天，以模擬中藥治療SO2污染損傷；中藥預(yù)防組自染毒處理前一周起，予肺痹湯2號(hào)方溶液10 mL/kg·bw灌胃，至染毒處理后第21天止，共灌胃28天，以模擬應(yīng)用中藥預(yù)防SO2肺損傷。空白對(duì)照組及模型組從染毒處理前一周到染毒處理后第21天，予0.9%生理鹽水10 mL/kg·bw灌胃，共灌胃28天。

1.2.4 動(dòng)物處死及取材 染毒處理后第21天結(jié)束之后，動(dòng)物禁食、自由飲水20個(gè)小時(shí)，于次日早上8點(diǎn)，稱重后以脫頸椎法處死小鼠。立即打開(kāi)小鼠胸腔，肉眼觀察雙肺的形態(tài)、質(zhì)地、顏色及有無(wú)明顯的肺纖維化結(jié)節(jié)等改變。以5 mL冰冷生理鹽水從右心室處注入，通過(guò)肺循環(huán)灌洗肺臟，反復(fù)幾次，至雙肺呈白色，立即將肺臟采出，稱重。取小鼠左側(cè)肺臟，在10倍于組織重的冰冷生理鹽水中用不銹鋼剪將肺組織剪碎，用玻璃勻漿器在0～4℃下研磨制成勻漿液。勻漿液用Hettich高速冷凍離心機(jī)在4℃下12000 rpm離心5分鐘，取上清液即得到肺組織的粗酶提取液，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法進(jìn)行IL -6、TGF-β1檢測(cè)。四組小鼠中每組選取6只小鼠用Real time-PCR方法檢測(cè)小鼠肺臟組織中IL -6 mRNA、TGF-β1 mRNA、乳腺?gòu)?fù)原蛋白-39(breast recovery protein-39，BRP-39) mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 中藥肺痹湯2號(hào)方顆粒對(duì)染毒小鼠肺組織IL-6的影響

與空白對(duì)照組相比，吸入SO2的模型組小鼠肺組織內(nèi)IL-6、IL -6 mRNA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，中藥治療組及中藥預(yù)防組小鼠肺組織內(nèi)IL-6、IL -6 mRNA含量均有下降趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上未見(jiàn)顯著意義。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺組織IL-6及IL-6 mRNA含量比較

2.2 中藥肺痹湯2號(hào)方顆粒對(duì)染毒小鼠肺組織TGF-β1的影響

與空白對(duì)照組相比，吸入SO2的模型組小鼠肺組織內(nèi)TGF-β1、TGF-β1 mRNA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，中藥預(yù)防組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA含量顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肺組織TGF-β1及TGF-β1 mRNA含量比較

2.3 中藥肺痹湯2號(hào)方顆粒對(duì)染毒小鼠肺組織BRP-39 mRNA的影響

與空白對(duì)照組相比，吸入SO2的模型組小鼠肺組織內(nèi)BRP-39 mRNA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，中藥預(yù)防組小鼠肺組織BRP-39 mRNA含量顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肺組織BRP-39 mRNA含量

3 討論

SO2對(duì)組織的致炎作用是其毒理作用重要機(jī)制[5]。應(yīng)用中醫(yī)藥是否可以干預(yù)炎性損傷過(guò)程，目前這方面的研究很少。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證明，在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，中藥經(jīng)過(guò)配伍形成的方劑肺痹湯 2 號(hào)可以促進(jìn) SO2染毒小鼠肺組織炎性滲出的吸收。

SO2污染存在于無(wú)法控制的環(huán)境空氣中，是一種外來(lái)毒邪。SO2損傷人體先經(jīng)鼻咽，入肺后直接消耗肺氣，損傷正氣，影響肺之宣發(fā)、肅降；對(duì)于宿有肺疾之人，其氣本虛，SO2可致肺氣更虛，導(dǎo)致疾病癥狀加重或誘發(fā)宿疾，使氣血津液運(yùn)行失常，產(chǎn)生氣滯、痰凝、血瘀等病理變化。針對(duì)以上對(duì)于病因病機(jī)的分析，應(yīng)以扶正祛邪為基本治療原則，故立治法為：補(bǔ)氣解毒，化痰通絡(luò)，制定肺痹湯2號(hào)方。

肺痹湯2號(hào)方是由全國(guó)名老中醫(yī)周平安教授的經(jīng)驗(yàn)方肺痹湯化裁而來(lái)。周平安教授用此方治療肺纖維化之肺氣虧虛，痰瘀阻絡(luò)證，臨床收效甚宏[6-7]。周平安教授認(rèn)為肺間質(zhì)纖維化的病機(jī)以肺氣虛損為內(nèi)因，外邪乘肺虛而內(nèi)舍于肺，肺氣虛無(wú)力鼓動(dòng)血脈則血運(yùn)遲緩，又有邪氣閉阻肺絡(luò)，氣血失和，氣血失于流暢，日久血液瘀滯，與痰濁搏結(jié)，痰瘀痹阻肺絡(luò)而發(fā)。病機(jī)與SO2肺損傷相近，肺氣虛損，邪氣傷肺，瘀血、痰濁等繼發(fā)的病理產(chǎn)物互相搏結(jié)，留于肺絡(luò)，治療需補(bǔ)益肺氣，化痰通絡(luò)。不同之處在于治療SO2肺損傷除補(bǔ)肺氣，化痰通絡(luò)外，還需解毒祛邪，故將肺痹湯化裁，減少其化痰通絡(luò)之藥味，增強(qiáng)解毒祛邪之力，故定名為肺痹湯2號(hào)。方中黃芪補(bǔ)益肺脾之氣，益衛(wèi)固表，升陽(yáng)舉陷，利水消腫，托毒生肌; 紅景天補(bǔ)益肺氣、健脾補(bǔ)虛、收澀止血、活血散瘀，與黃芪相配合補(bǔ)益肺氣，扶助正氣，二者共為君藥。金銀花清熱解毒，散癰消腫，疏散風(fēng)熱，黃芩清熱燥濕，瀉火解毒，與金銀花配合增強(qiáng)解毒祛邪之力，二者為臣藥。丹參活血通經(jīng)，涼血消腫，在本方中為佐藥，針對(duì)肺氣受損、血行遲滯的病機(jī)變化。甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥的作用，既可助黃芪補(bǔ)益肺氣，又能祛痰止咳解毒，還可調(diào)和諸藥，為佐使藥。全方共奏補(bǔ)益肺氣、解毒、化痰、活血之功。

近年來(lái)許多研究證明，SO2進(jìn)入呼吸系統(tǒng)后可以造成肺組織損傷，SO2及其衍生物可激活血液淋巴細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生大量致炎細(xì)胞因子[8]，IL-6、TGF-β1、BRP-39在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，在小鼠的肺部炎癥和損傷中起著關(guān)鍵的作用。IL-6的基因表達(dá)失常是解釋許多疾病的基礎(chǔ)，IL-6主要產(chǎn)生于激活的巨噬細(xì)胞，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，它既能調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞的免疫活性，又參與某些免疫病理的發(fā)生[9]。TGF-β1是一種抗炎因子，可以抑制T、B細(xì)胞增殖，減少主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類(lèi)抗原表達(dá)，減輕局部炎癥反應(yīng)。TGF-β是放射致肺損傷過(guò)程中最重要的細(xì)胞因子，它可趨化炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞合成IL-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)，同時(shí)還調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM) 包括I、Ⅲ型膠原蛋白的合成增加，減少ECM的降解。BRP-39是存在于哺乳動(dòng)物中的一種殼質(zhì)酶類(lèi)似物蛋白，被認(rèn)為是在哺乳動(dòng)物中的一種表型， 在小鼠稱為BRP-39[10]， 在人的同系物則稱為甲殼質(zhì)酶蛋白-40(chitinase protein-40，YKL-40)，YKL-40表達(dá)和分泌的增加被認(rèn)為與許多以組織重構(gòu)、炎癥反應(yīng)和纖維化為特征的疾病相關(guān)，如哮喘、肺結(jié)節(jié)病、過(guò)敏性皮炎、腸道炎等炎癥性疾病等。YKL-40能抑制氧化劑誘導(dǎo)的肺損傷，增加對(duì)Th2免疫的適應(yīng)性，調(diào)節(jié)凋亡，刺激交替性巨噬細(xì)胞的活化，并促進(jìn)組織纖維化和傷口愈合，其參與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制。與空白組小鼠相比，模型組小鼠肺組織的IL-6、IL-6 mRNA 、TGF-β1、TGF-β1 mRNA、BRP-39 mRNA含量顯著升高，表明了SO2對(duì)肺組織細(xì)胞的致炎作用。中藥預(yù)防組小鼠與模型組小鼠相比， TGF-β1、TGF-β1 mRNA、BRP-39 mRNA含量顯著減少，說(shuō)明肺痹湯2號(hào)對(duì)于小鼠肺損傷后炎癥因子高表達(dá)有一定的抑制作用，表明肺痹湯2號(hào)對(duì)小鼠肺組織損傷起到了一定的保護(hù)作用。