凍干重組結核桿菌融合蛋白(EC)原液效力評價用國家參考品的初步建立

都偉欣 韋芬 盧錦標 趙愛華 蒲江 王國治 徐苗

重組結核桿菌融合蛋白(EC)[該制品名稱是國家藥典委員會確定的藥品中文通用名稱，“EC”為重組融合蛋白“結核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)”](以下簡稱“EC”)是由ESAT-6和CFP-10的基因經融合表達、系列純化后制備而成的皮膚試驗試劑，具有結核分枝桿菌復合群抗原特異性，可將其作為變態反應原用于結核感染篩查[1-5]；或與結核菌素純蛋白衍生物(PPD)聯用，用于鑒別卡介苗接種與結核感染，區分卡介苗接種后陰轉或無結核感染、卡介苗接種后維持陽性、結核感染這三類人群；也可用于結核病的臨床輔助診斷。因此，該類產品在臨床使用中的效價非常關鍵，但目前EC作為新上市的產品，并無相應的國家或國際參考品以評估其原液效價、監測其產品質量。為此，中國食品藥品檢定研究院開展了凍干EC原液效力評價用國家參考品的研制工作，以期為規范此類產品效價的檢測、促進檢定結果的標準化提供支持。

材料和方法

一、原材料

1.凍干EC原液：批號M20170901；規格為508 μg/瓶，1 ml安瓿瓶；委托安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司制備。該凍干品作為本研究的候選國家參考品。

2. EC原液：批號M20101202和M20170901，均為液體劑型，由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供。

3.動物致敏用菌株：結核分枝桿菌CMCC(B) 93020(H37Ra)活菌菌液，濃度2 mg/ml，本室制備。

4. 動物：(1)無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級Hartley豚鼠：性別不限，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供；實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2014-0013。在中國食品藥品檢定研究院分枝桿菌專業實驗室的負壓動物房飼養。(2)穩定性評價用SPF級Hartley豚鼠：雌性，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供；實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011。在上海復旦大學三級動物生物安全實驗室(ABSL-3C)的負壓區飼養。每只豚鼠大腿腹股溝皮下注射0.5 ml H37Ra活菌菌液。

二、主要試劑和儀器

牛血清白蛋白(21.8 mg/支)由本院提供；丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、溴酚藍、Tween 80、考馬斯亮藍R250均為VER Life Science Amresco公司產品；十二烷基硫酸鈉(SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺均為西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)(上海)貿易有限公司產品；蛋白Marker為寶生物工程(大連)有限公司產品；Na2HPO4·12H2O(色譜級)、NaH2PO4·2H2O(色譜級)、NaCl(色譜級)為天津市光復精細化工研究所產品。卡爾費休試劑為上海凌峰化學試劑有限公司生產；無水甲醇為國藥集團化學試劑有限公司產品。

紫外-可見分光光度計(UV-2450)為島津儀器(蘇州)有限公司產品；電子天平(BSA623S-CW)、(SECURA225D-1CN)為賽多利斯科學儀器(北京)有限公司產品；旋渦混合器為上海琪特分析儀器有限公司產品；電泳儀電源、垂直電泳儀、凝膠成像系統(Gel DOCTM EZ)為伯樂(Bio-Rad)生命醫學產品(上海)有限公司產品；高效液相色譜儀(LC1260)為安捷倫科技(中國)有限公司產品；卡爾費休滴定儀(DL38)為梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司產品。

三、候選國家參考品的制備及質量控制

按照EC原液質量標準對備選凍干EC原液(批號：M20170901)進行純度檢定，合格后以0.5 ml/安瓿瓶每支均精確稱量進行分裝，同時也完成了候選國家參考品的均勻性檢測。分裝后凍干成為EC變態反應原原液效力評價用國家參考品的候選品。按照《中國藥典(2015年版 三部)》[6]對候選國家參考品進行蛋白質含量和水分等質量檢測。

1.純度測定及質量要求：對EC原液采用電泳法和高效液相色譜法(HPLC)兩種方法進行純度檢驗，確證純度符合要求。電泳法：采用非還原型十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法，分離膠濃度為12.5%，加樣量應≥10 μg (考馬斯亮藍R250染色法)，經掃描儀掃描，純度≥95.0%為合格。高效液相色譜法：色譜柱為Phenomenex BioSep-SEC-S2000(7.8 mm×300 mm)，流動相為pH=7.0的0.1 mol/L磷酸鹽-氯化鈉緩沖液(磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉按比例進行配制，磷酸根濃度為0.1 mol/L)；上樣量≥10 μg，于波長280 nm處檢測，認為EC原液蛋白主峰計算的理論板數應不低于1000時，分離效果未受影響。按面積歸一化法計算，以EC原液蛋白主峰面積≥95.0%總面積為合格。

2.蛋白質含量測定及質量要求：采用福林酚檢驗方法對候選國家參考品進行蛋白含量檢定，結果應不低于450 μg/瓶。

3.水分測定及質量要求：以卡爾費休滴定法對候選國家參考品進行檢定，水分含量應不高于3.0%。

四、均勻性檢測

取1 ml EC原液進行稱重，根據質量體積比求得密度，再計算出每支分裝量為0.5 ml候選國家參考品的理論裝量，且每支均在分裝時進行精密稱量，以保證裝量范圍控制在“(1±1%)每支理論裝量(g/支)”之間。

五、候選國家參考品的初步性能評價

1. 確定候選國家參考品效價測定用的適宜稀釋度：將候選國家參考品復溶后，分別稀釋至1.0 μg/ml(5 U/ml)、2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)、10 μg/ml(50 U/ml)和20 μg/ml(100 U/ml)。取6只已經被H37Ra活菌致敏的豚鼠，去毛后于背部脊柱兩側分別于皮內注射上述稀釋度樣品各0.1 ml，注射后24 h觀察并測量局部硬結或紅暈的縱徑和橫徑(取硬結或紅暈反應大者)，計算硬結或紅暈反應平均直徑(縱徑與橫徑相加除以2)，繪制皮膚試驗硬結或紅暈反應平均直徑大小(簡稱“反應平均直徑大小”)與不同稀釋濃度所對應的劑量對數反應平均直徑大小曲線。選擇注射后24 h所產生的局部硬結或紅暈反應直徑≥8 mm、具有劑量對數反應平均直徑大小曲線有良好線性關系(R2≥0.9為線性良好)的3個稀釋度作為候選國家參考品進行效價測定用的適宜稀釋度。

2. 候選國家參考品用于EC原液的效價測定標定：將候選國家參考品與企業申報臨床用EC原液(批號：M20101202)分別稀釋至確定好的不同稀釋度，以輪圈法皮內注射0.2 ml以上樣品于6只去毛的已經被H37Ra活菌致敏豚鼠的背部脊柱兩側，注射后24 h觀察并測量局部硬結或紅暈的縱徑和橫徑(以硬結或紅暈反應大者為準)，計算平均硬結或紅暈反應(縱徑與橫徑相加除以2)。不同稀釋度候選國家參考品注射后產生的局部硬結或紅暈反應直徑應不小于8 mm，且能使不同稀釋度EC原液的反應平均直徑大小均值與相應稀釋度國家參考品相應均值的比值滿足1.0±0.2，并且兩者的劑量對數反應平均直徑大小曲線趨勢應相似或一致。

注 在波長為280 nm時檢測。保留時間為組分出峰達到最大值的時間。相對吸光強度值：1 mAU值=0.001 A值。峰高=相對吸光強度值(mAU)/(5.69×10-5)。USP為美國藥典委員會標準。理論塔板數是定量表示色譜柱的分離效率指標，數值越大色譜柱效率越高，在USP標準下應不低于1000；分離度表示相鄰兩峰的分離程度，數值越大表明相鄰兩組分分離越好，在USP標準下，當數值為1.5時，稱為6σ分離，分離度(裸露峰面積)可達99.7%，以≥1.5為完全分離。不對稱性又稱拖尾因子，可檢驗色譜峰是否對稱，預設<2.0為結果可靠，可以采用；S/N(6 σ)為6σ質量標準下的檢驗微量物質的能力，不應該低于10

3.效價測定的方法驗證：本研究對候選國家參考品用于EC原液效價測定進行了方法驗證，該試驗所用EC原液批號為M20170901。

4.初步穩定性觀察：將-20 ℃放置24個月的候選國家參考品用于EC原液(批號M20170901)的效價測定。并在后期的使用過程中，將定期對該候選國家參考品進行期間核查及長期穩定性研究。

六、統計學處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行數據處理，組間比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、EC原液及候選國家參考品的檢驗結果

EC原液采用非還原型SDS-PAGE法測定的蛋白純度為100.00%(圖1，僅有一條色帶，無其他雜帶)。高效液相色譜法結果顯示，目的蛋白出峰時間為10.823 min，主峰面積占總面積的95.33%，蛋白純度為95.33%(圖2)；水分含量4次測定結果分別為1.30%、1.71%、1.63%、1.64%，平均為1.57%；福林酚法測得侯選參考品蛋白質含量為508 μg/瓶。

1為蛋白Marker[從上至下：97.2 kDa、66.4 kDa、44.3 kDa、29.0 kDa、20.1 kDa、14.3 kDa(1 kDa的相對分子質量為1000)]；2為通過SDS-PAGE 檢測的EC原液蛋白純度圖1 SDS-PAGE電泳法備選EC原液蛋白純度檢測結果

二、均勻性檢測結果

取1 ml EC原液稱重，根據質量體積比求得EC原液密度為1.037 g/ml，根據密度求出每支0.5 ml的理論裝量應為0.519 g。分裝階段均進行精密稱量，每支候選國家參考品分裝量范圍在0.514～0.524 g之間，因此，分裝精度控制在±1%以內，均勻性檢測符合國家參考品制備要求。

三、確定候選國家參考品原液效價測定用適宜稀釋度

將進行豚鼠皮膚試驗的候選國家參考品不同稀釋度的劑量對數值與相應的反應平均直徑大小繪制劑量對數反應平均直徑大小曲線(圖3)，經四參數擬合曲線方程為Y=9.922+(20.43-9.922)/[1+10(0.7786-X)×3.257](Y為反應平均直徑大小，X為劑量對數)，得出R2=0.8140。其中，1.0 μg/ml和2.5 μg/ml所對應的反應平均直徑大小(均值分別為10.3 mm和10.1 mm)，經配對t檢驗，差異無統計學意義(t=0.124，P=0.906)，處于平臺反應期，劑量所對應的反應平均直徑大小無差異；10 μg/ml和20 μg/ml所對應的反應平均直徑大小(均值分別為18.6 mm和20.3 mm)，經配對t檢驗，差異也無統計學意義(t=2.236，P=0.076)，處于平臺反應期；而在2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml稀釋度時線性關系最好(R2=0.9944)，可將這3個候選國家參考品的稀釋度確定為效價測定用適宜稀釋度。

四、候選國家參考品用于EC原液的效價測定及驗證結果

將候選國家參考品用于EC原液的效價測定，其豚鼠皮試反應結果顯示，不同稀釋度(2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml)的EC原液和相應稀釋度候選國家參考品皮膚試驗反應平均直徑大小均>8 mm，每個稀釋度EC原液和相應稀釋度候選國家參考品反應平均直徑大小均值的比值均在1.0±0.2范圍內，且兩者劑量對數反應平均直徑大小曲線趨勢基本一致，線性方程分別為Y=4.152X+17.38(R2=0.9643)和Y=7.198X+17.16(R2=0.9878)(Y為反應平均直徑大小，X為劑量對數)(圖4)。

劑量對數值為不同稀釋濃度的對數值圖3 候選國家參考品梯度稀釋后不同劑量所對應的皮膚試驗反應結果

劑量對數值為不同稀釋濃度的對數值圖4 候選國家參考品用于EC原液效價測定的皮膚試驗反應結果

效價測定的方法驗證結果顯示，候選國家參考品劑量對數反應平均直徑大小曲線有良好的線性關系(Y=5.813X+13.05，R2=0.9999；Y為反應平均直徑大小，X為劑量對數)，與EC原液劑量對數反應平均直徑大小曲線趨勢一致(Y=6.782X+12.73，R2=0.9815；Y為反應平均直徑大小，X為劑量對數)。且兩者相應稀釋度對應的反應平均直徑大小均值的比值也在1.0±0.2范圍內(圖5)。

劑量對數值為不同稀釋濃度的對數值圖5 候選國家參考品效價測定的驗證試驗的結果

劑量對數值為不同稀釋濃度的對數值圖6 候選國家參考品效價測定的皮膚試驗反應結果(穩定性研究)

五、初步穩定性檢驗結果

-20 ℃放置24個月的候選國家參考品用于EC原液的效價測定，結果顯示候選國家參考品劑量對數反應平均直徑大小曲線仍有良好的線性關系(Y=3.599X+16.35，R2=0.9694；Y為反應平均直徑大小，X為劑量對數)，同時與EC原液劑量對數反應平均直徑大小曲線趨勢一致(Y=3.045X+16.26，R2=0.9973；Y為反應平均直徑大小，X為劑量對數)。每個稀釋度EC原液與相應稀釋度候選國家參考品反應平均直徑大小均值的比值均在1.0±0.2范圍內(圖6)。

討 論

EC作為結核感染篩查的體內診斷試劑，其效價測定是該類產品質量穩定和有效的重要指標。此類產品效價測定要求是應不低于參考品的效價，因此參考品對產品的質量控制至關重要。為便于產品的質量檢查，企業會建立相應的企業參考品，但隨著不同企業對此類產品的相續研發，將來應不斷會有同類產品上市[10-15]。這時國家參考品的研制變得極為重要，研制成功可對目前和將來此類產品的研發和上市生產所制備產品中的效價測定提供可控可評的參考指標。尤其是新研發產品可應用國家參考品來測定產品的效價，評價產品性能。

制備國家參考品時，質量標準檢測指標一般會高于企業參考品。此類產品一般為大腸埃希菌表達的重組蛋白，因此純度指標較為關鍵。備選EC原液經檢測，其電泳法和高效液相色譜法的純度均在95%以上，尤其是電泳法的純度高達100.00%。企業參考品一般為液體劑型，考慮到國家參考品長期保存和使用的穩定性，本研究在候選國家參考品制備時加入凍干保護劑進行冷凍干燥，制成凍干劑型。凍干制劑的水分含量會是參考品的重要質量控制指標。經測定，候選國家參考品的水分含量為1.57%，遠高于標準要求的不高于3.0%；其蛋白質含量檢測結果為508 μg/瓶。為了滿足國家參考品的均一性要求，該候選品在分裝階段即對每支進行精確稱重，保證了分裝精度。最終分裝精度控制在±1%范圍內，均一性評價完全符合國家參考品的要求。

EC原液效價測定采用的是豚鼠皮膚試驗。一般隨著皮膚試驗試劑劑量的增加，所對應的皮膚試驗反應平均直徑大小也相應增加。但應該會有一個合適的劑量區間，皮膚試驗反應是呈正相關的，低于或者高于一個劑量范圍，皮膚試驗反應平均直徑大小會處于一個平臺期。本研究發現凍干國家參考品在2.5 μg/ml(12.5 U/ml)以下和10 μg/ml(50 U/ml)以上劑量時皮膚試驗反應會呈平臺期反應，而在2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)和10 μg/ml(50 U/ml)3個不同稀釋度時劑量效應反應平均直徑大小曲線的線性關系最好，故認為2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)和10 μg/ml(50 U/ml)3個不同稀釋度是候選國家參考品進行EC原液效價測定時的適宜稀釋度。

該次研究選用的EC原液是企業申報臨床時所用的原液，結果顯示，不同稀釋度EC原液和相應稀釋度候選國家參考品的反應平均直徑大小均>8 mm，相應稀釋度反應平均直徑大小均值的比值在1.0±0.2范圍內，且兩者劑量對數反應平均直徑大小曲線趨勢基本一致。說明候選國家參考品適用于EC原液的效價測定。同時，對候選國家參考品用于EC原液的效價測定進行了方法驗證，結果顯示候選國家參考品的劑量對數反應平均直徑大小曲線有良好的線性關系(Y=5.813X+13.05，R2=0.9999)，與EC原液的劑量對數反應平均直徑大小曲線趨勢一致(Y=6.782X+12.73，R2=0.9815)。每個稀釋度EC原液與相應稀釋度候選國家參考品反應平均直徑大小均值的比值均在1.0±0.2范圍內，說明候選國家參考品用于EC原液效價測定方法可行，檢測結果可靠。穩定性研究結果顯示：-20 ℃放置24個月的候選國家參考品用于EC原液效價測定時，其劑量對數反應平均直徑大小曲線與EC原液的曲線趨勢一致，各稀釋度EC原液與相應稀釋度候選國家參考品反應平均直徑大小均值的比值均在1.0±0.2范圍內，說明候選國家參考品性能非常穩定。

本研究制備的候選國家參考品目前只完成了初步評價工作，后續將進一步完成多家協作標定和加速破壞穩定性評價等研究工作。該國家參考品完全研制成功后可用于EC蛋白或者同類產品的質量控制，能促進此類產品效價檢測的標準化。