XN-2000體液檢測模式在漿膜腔積液有核細胞計數中的應用

魯小龍,徐海波

四川大學華西廣安醫院 檢驗科(廣安 638000)

漿膜腔積液標本的有形成分分析(如有核細胞計數)目前仍以手工顯微鏡鏡檢檢測法為常用方法[1]，該方法沿用多年，具有操作過程復雜、重復性差、易受操作者影響、不易標準化等缺點。隨著儀器自動化的發展，檢驗工作者一直在探索利用儀器法檢測原理對漿膜腔積液進行檢測，但各類報道關于漿膜腔積液檢測儀器法檢測的結論不一[2-11]。Sysmex XN-2000血細胞分析儀結合多種細胞分析檢測技術，采用專門的體液檢測通道，是少數可以應用于體液細胞檢測的血細胞分析儀之一。本研究收集136例臨床患者的漿膜腔積液標本，分別用XN-2000血細胞分析儀的體液模式(以下簡稱儀器法)和顯微鏡鏡檢計數法進行計數(以下簡稱手工法)，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年1-12月四川大學華西廣安醫院臨床科室送檢的各類漿膜腔積液標本136例，其中男83例，女53例;胸水75例，腹水61例。年齡16～93歲；所有標本采集后用EDTA-K2抗凝劑處理，均無肉眼可見的凝塊，排除血性、膿性標本，標本采集后，在2 h內完成檢測(包括儀器及手工檢測)。

1.2 儀器與試劑

Sysmex XN-2000血細胞分析儀(日本Sysmex公司)，原裝配套試劑及質控品(稀釋液：G9473,溶血劑WNR：A9053，染液WNR：A9083，溶血劑WDF：A9050，染液WDF：9113，溶血劑SLS：A9019，質控品：00781102)，經校準后的改良Neupauer計數板，微量毛細吸管，蓋玻片，日本Olympus CX-31雙目顯微鏡，一次性塑料試管，分析純冰醋酸溶液。

1.3 檢測步驟與方法

每份標本收到后分別按以下兩種方法進行檢測。

1.3.1 儀器法檢測 按Sysmex XN-2000血細胞分析儀儀器操作手冊進行檢測，每次檢測體液標本前，儀器切換到手動體液模式，自動進行儀器本底檢測，確保檢測通道中計數為0，防止攜帶污染。檢測操作同手動檢測血細胞樣本，上機前充分混勻標本，肉眼觀察是否有凝塊，防止產生氣泡。開蓋上機后，按“開始”按鈕自動進行細胞計數及分類檢測。

1.3.2 手工法檢測 由長期從事臨床檢驗的高年資技術人員，按《全國臨床檢驗操作規程》第4版[12]要求，先加冰醋酸1～2滴到小試管內，轉動試管使管內壁沾有冰醋酸，后棄去冰醋酸，滴加混勻的漿膜腔積液標本3～4滴進入試管，數分鐘后，混勻充入加有蓋玻片的計數池，顯微鏡下按白細胞計數法計數有核細胞數。每份計數樣本均計數2次，取均值作為檢測結果，最后將有核細胞數結果換算成106個/L。

1.4 分組

以手工法檢測有核細胞總數計數結果為參考標準，將所有標本分為A組(≤100×106個/L)和B組(>100×106個/L)兩組,A組樣本數為29例，B組樣本數為107例。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件對各組數據進行正態分布檢驗，對不符合正態分布數據進行非參數Spearman雙變量相關性分析和配對非參數秩和檢驗，計算線性回歸方程。檢驗水準α除特別說明外均設定為0.05。

2 結果

2.1 儀器法WBC重復性檢測

選擇A組和B組中樣本各1例，分別代表低值組和高值組，每個標本連續復測11次，去除第1次檢測結果，變異系數均<5.0%(表1)。

表1 XN-2000檢測WBC精密度

2.2 儀器法和手工法檢測漿膜腔積液有核細胞計數結果比較

經正態分布檢驗分析，兩種方法有核細胞計數結果的P值(sig.)在A組中依次為0.007、0.045，在B組中依次為0.000、0.000(P<0.05)，故均不符合正態分布。經非參數相關性分析，A組與B組兩種方法的Spearman相關系數分別為0.913、0.998，呈顯著性正相關(P<0.001)；兩組中儀器法相對于手工法計數結果的線性回歸方程為分別為：y=0.945x+8.932，y=1.006x+26.959。儀器法較手工法檢測結果偏高，差異均有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組數據配對非參數秩和檢驗結果(×106個/L)

3 討論

漿膜腔積液有形成分計數在臨床醫生診斷漏出液、滲出液，胸腹膜炎癥和惡性腫瘤中具有重要意義[12]。手工法計數漿膜腔積液細胞雖然被認定為參考方法[13]，但其缺點也顯而易見：手工計數精度差，不同人員重復性差，操作時間長、過程繁瑣(人工吸樣、充池、沉淀、顯微鏡調整，離心制片、染色等)，分析過程很難做到標準化，生物安全方面還存在交叉感染風險，不易進行質量控制等[14]。

XN-2000血細胞分析儀體液模式采用直流電阻/射頻電阻檢測法(RF/DC檢測)，液壓聚集法(DC檢測)、半導體流式細胞細胞計數法、核酸熒光染色法等檢測手段，對漿膜腔積液中的有形成分進行計數并分類，標本用量僅需88 μL，反應迅速，從將標本混勻后放入儀器至檢測完成的時間不超過2 min；同時無需對標本進行特殊處理(但對于膿性，有凝塊的標本，不能用于該儀器的檢測，以防堵塞儀器)[14]。此外該儀器還提供直觀的散點圖及高熒光強度有核細胞(HF)計數等參數，據報道此參數可用于惡性腫瘤脫落細胞的篩查[15-17]。

本研究中兩種方法檢測結果經正態分布檢驗，數據均不符合正態分布。經非參數相關分析，A組與B組的Spearman相關系數分別為0.913，0.998，均呈顯著正相關(P<0.001)。兩組中儀器法相對于手工法線性回歸方程依次為y=0.945x+8.932，y=1.006x+26.959。儀器法檢測漿膜腔積液的重復性實驗中，高低濃度樣本均顯示具有較好的精密度，在白細胞計數較小時，變異系數較大，較大時，變異系數更小，且都在允許范圍之內，這與已報道的相關結果相符[18]，能夠滿足臨床診療的需要。由表2可知，A組與B組中兩種方法計數結果存在顯著性差異(P<0.05)，各組內中位數，25%位數，75%位數均顯示儀器法較手工法偏高。經分析造成這種差異有以下幾個方面的原因：1)儀器計數的細胞總量大，標本是按1∶50稀釋儀器進行檢測計數，當細胞數偏低時，還會自動擴大細胞計數量，從統計學角度，會提高結果的精密度與準確性。而手工法計數實際只有1 μL標本的內數量，若遇細胞數多時，還會用冰醋酸進行稀釋后再進行計數，會增大誤差。2)手工法在稀釋、處理，吸樣、充池等過程中，會對有核細胞產生破壞，引起計數結果偏低，尤其是充池后時間越長影響越大。但如果充池后立即計數由于細胞分布不均等原因，會引起細胞的計數結果產生偏差。3)樣本的黏稠度也會影響計數結果，手工法中因樣本黏稠度會導致細胞粘連導致細胞不易充入計數池，還會影響細胞分布不均，而儀器法將樣本按50倍稀釋后計數，可以克服樣本黏稠度的影響。4)樣本中脫落的間皮細胞，未成熟細胞，腫瘤細胞和膿細胞等，有成堆成團聚集的現象，分布不均，會影響計數結果。而儀器法采用核酸熒光染色法，可對這類細胞進行分析計數，顯示在散點圖的右上角高熒光細胞區。結合計數結果與散點圖，可對此類細胞進行初步篩查[15-17]。5)手工法中，操作人員對細胞的認識不同和對計數板使用的熟練程度，也會影響計數結果準確性[6,19]。

綜上所述，XN-2000血細胞分析儀體液檢測模式具有操作簡單迅速、結果準確可靠、減少人為操作誤差等優點，可應用于漿膜腔積液有核細胞計數檢測。但由于漿膜腔積液本身成分復雜和儀器非直接檢測形態的特點，故XN-2000血細胞分析儀目前不能完全代替人工鏡檢。如當儀器出現散點圖異常和高熒光細胞增高時，還應手工鏡檢確認；同時，膿性標本和有凝塊的樣本由于儀器特點，也限制了其應用。