蒙藥藍刺頭抗絕經后骨質疏松癥骨微觀形態學計量研究

趙軍 董重陽 師建平 劉晉 黨贏 常虹 海日 李婧

1.內蒙古自治區中醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010020 2.南京中醫藥大學研究生院；江蘇 南京 210023 3.內蒙古醫科大學中醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110 4.內蒙古醫科大學附屬醫院中醫科，內蒙古 呼和浩特 010050

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)以骨量低下，骨微結構破壞，骨脆性增加，易發骨折為特征的全身性骨病[1]。2001年美國國立衛生研究院將OP定義為骨強度下降、骨折風險增加為特征的骨骼系統疾病[2]。OP分原發性、繼發性兩類。原發性OP臨床常見，包括絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)(Ⅰ型)、老年OP(Ⅱ型)、特發性OP(包括青少年型)。PMOP即Ⅰ型原發性OP，以進行性骨丟失、骨小梁退行變、骨質疏松、骨脆性增加、骨折風險增加為臨床特征的全身疾病，具有發病率隨絕經年限延長而增高特點[3]。本病常見多發于絕經后(自然絕經、手術絕經)婦女，主因絕經后卵巢功能衰竭。卵巢功能衰竭，雌激素水平下降，骨鈣素分泌減少，破骨細胞作用增強致骨吸收加快；雌激素水平下降抑制甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)分泌，繼發甲亢，腎維生素D失活，從而使1，25(OH)2D3生成減少，腸吸收鈣功能下降，骨礦攝入量不足終致骨合成減少[4]。PMOP骨吸收與骨形成均加快，按骨重建異常病理分類，PMOP屬高轉換型[5]。

蒙醫典籍《觀者之喜》“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以補為主，補暖補精，而抑赫依過剩……”。老年人屬“體熱趨于減弱，顯示赫依優勢”體質[6]，此時體內“赫依”體素過剩，使體內“三根、七素”平衡失調，分解、吸收、排泄功能紊亂，精華、糟粕分解不充，骨精減少，發生骨枯癥[7]，骨脆性增加易骨折。蒙藥藍刺頭(Echinops sphaerocephalus L.)味苦，性涼，效稀、柔、鈍、輕，有固骨質、接骨愈傷、清熱解毒，殺“粘”止痛等效，治筋骨折傷、骨傷熱、刺痛、金創、瘡瘍等[8]。研究顯示[9-12]，蒙藥藍刺頭可通過雌激素樣作用促骨形成，調節骨吸收/骨形成偶聯，降低骨轉換率，達防治PMOP的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1造模動物、實驗藥物：造模動物選擇6月齡SD系SPF級雌性大鼠84只，購自內蒙古醫科大學實驗動物中心，許可證：SYXK(蒙)2015-0001。蒙藥藍刺頭原藥購于內蒙古民族大學附屬醫院，由內蒙古醫科大學方劑學重點實驗室制備。輔酶Q10片(Co-Q10)[Eisai衛材(中國)藥業有限公司生產，10 mg/片]。淫羊藿(Herba Epimedii)顆粒購于國醫堂，北京康仁堂藥業有限公司，產品批號：13005361。

1.1.2實驗設備與器材：1/1000電子稱(生產廠家：凱豐集團有限公司；型號：JA503)；微型電子稱(生產廠家：長沙湘平科技發展有限公司；型號：ES-600S)；電子天平(生產廠家：上海海康電子儀器廠；型號：ACS-H1型電子計重稱)；Micro-CT(內蒙古醫科大學附屬醫院PET-CT室)。4%甲醛液等由內蒙古醫科大學中醫學院實驗中心提供。造模及取材相關手術器械等耗材。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組、建立模型：按隨機原則將大鼠分7組，每組12只，假手術組(Sham)、去卵巢骨質疏松模型組(OVX)、蒙藥藍刺頭高劑量組(Echinops-H)、中劑量組(Echinops-M)、低劑量組(Echinops-L)、中藥對照組淫羊藿組(HEP)、西藥對照組輔酶Q10組(Co-Q10)。大鼠卵巢摘除法(去勢)制備PMOP大鼠模型[13]。

1.2.2造模是否成功判定：陰道上皮脫落細胞角化實驗[14]；去卵巢術后5 d，所有大鼠連續5 d行陰道上皮脫落細胞角化實驗，對比觀察動情周期，1次/d。消毒棉簽于大鼠陰道轉動取脫落細胞-單向涂抹載玻片轉移細胞-36%甲醛溶液固定15 min-20%甲基藍染液中染色45 min-蒸餾水沖片-封片-光學顯微鏡觀察-攝片(見圖1)。

圖1 不同時期大鼠陰道光鏡下圖片(×400) A：動情期；B：動情間期Fig.1 Light microscopic images of rat vagina at different stages (×400). A: Estrous period; B: Estrous interval

1.3 給藥方法

造模后飼養90 d后給藥干預。劑量均據人鼠體重比例、人鼠代謝速率比折算：蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組給藥劑量為：13、6.5、3.25 mg/mL。低劑量組為臨床等效劑量，高、中、低劑量比例為4∶2∶1。中藥對照組淫羊藿給藥劑量、西藥對照組輔酶Q10[15-16]均按成人劑量有效量，23.4375、0.0 313 mg/mL。模型組、假手術組給藥量以相同計算方式予生理鹽水。每日稱重記錄，觀察生命情況。

1.4 標本采集、指標檢測

處死取右側完整股骨，分裝于取樣杯4%多聚甲醒固定，采用骨密度(bone mineral density，BMD)儀離體骨(股骨近端BMD和股骨總BMD)BMD測定、Micro-CT離體骨定量參數分析、骨微結構三維重建、微觀形態學觀察。

1.5 數據的統計學處理PH

2 結果

2.1 骨密度測定

(1)與假手術組比較，模型組大鼠股骨近端BMD和全段BMD均明顯降低(P<0.05)，股骨全段BMD下降37.13%(P<0.05)，股骨近端下降23.42%。(2)與模型組比較，蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組、淫羊藿組、輔酶Q10組、假手術組股骨全段、近端BMD均明顯增高(P<0.05)。(3)與蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組比較，BMD計量結果西藥對照組輔酶Q10組優于蒙藥藍刺頭高、低劑量組，有統計學意義(P<0.05)；西藥對照組輔酶Q10組與蒙藥藍刺頭中劑量組比，二者無統計學意義(P>0.05)。BMD計量結果淫羊藿組優于蒙藥藍刺頭高、低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；淫羊藿組與蒙藥藍刺頭中劑量組比，二者差異無統計學意義(P>0.05)。(4)淫羊藿組與輔酶Q10組比較，BMD計量淫羊藿組略占優勢，但二者差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 骨形態學計量(Micro-CT)骨微結構測定

Micro-CT掃描三維重建測定各組大鼠右側股骨組織體積(bone volume，BV)、骨小梁體積分數(bone volume/tissue volume，BV/TV)(%)、骨小梁體積與興趣區間體積的比值(BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)(mm)、骨小梁寬度(trabecular widthness，Tb.Wi)(mm)、骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)(mm)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)(mm-1)、骨小梁模塊因素(trabecular pattern factor，Tb.Pf) (mm-1)值。(1)與假手術組比較，模型組大鼠骨微結構骨小梁立體網狀結構異常，骨微結構形態計量學各參數值BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Wi、Tb.N均明顯降低(P<0.05)；Tb.Sp、Tb.Pf增大(P<0.05)。骨小梁體積密度下降50.0%(P<0.05)。(2)與模型組比較，蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組、淫羊藿組、輔酶Q10組、假手術組骨微結構骨小梁立體網狀結構明顯改善(P<0.05)。蒙藥藍刺頭中劑量組、淫羊藿組、輔酶Q10組大鼠BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N明顯上升(P<0.05)，Tb.Sp、Tb.Pf明顯減少(P<0.05)。(3)與蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組比較，骨形態學計量測定結果輔酶Q10組優于蒙藥藍刺頭高、低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；輔酶Q10組與蒙藥藍刺頭中劑量組比較，二者差異無統計學意義(P>0.05)。骨形態學計量測定結果淫羊藿組優于蒙藥藍刺頭高、低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；淫羊藿組與蒙藥藍刺頭中劑量組比，二者差異無統計學意義(P>0.05)。(4)淫羊藿組與西藥對照組輔酶Q10組比較，骨形態學計量淫羊藿組略占優勢，但二者差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2～3，表2。

表1 各組大鼠股骨全段、近端骨密度比較

圖2 股骨全長冠狀位三維重建骨小梁顯示 A：假手術組；B：模型組；C：中藥對照淫羊藿組；D：蒙藥藍刺頭高劑量組；E：蒙藥藍刺頭中劑量組；F：蒙藥藍刺頭低劑量組；G：西藥對照輔酶Q10組Fig.2 Three-dimensional reconstruction of the femoral trabecula in full-length coronal position. A: Sham operation group (Sham); B: Model group (OVX); C: Traditional Chinese medicine control group (HEP); D: Mongolian medicine high dose group (echinops-h); E: Mongolian medicine medium dose group (echinops-m); F: Mongolian medicine low dose group (echinops-l); G: Western medicine irradiation coenzyme Q10 group (CoQ10).

圖3 股骨遠端松質骨感興趣區域定位 A：假手術組；B：模型組；C：中藥對照淫羊藿組；D：蒙藥藍刺頭高劑量組；E：蒙藥藍刺頭中劑量組；F：蒙藥藍刺頭低劑量組；G：西藥對照輔酶Q10組Fig.3 Location of region of interest in cancellous bone of the distal femur. A: Sham operation group (Sham); B: Model group (OVX); C: Traditional Chinese medicine control group (HEP); D: Mongolian medicine high dose group (echinops-h); E: Mongolian medicine medium dose group (echinops-m); F: Mongolian medicine low dose group (echinops-l); G: Western medicine irradiation coenzyme Q10 group (CoQ10).

表2 各組大鼠股骨干干骺端松質骨Micro-CT微觀結構參數Table 2 Microstructure parameters of the cancellous bone in the metaphyseal femur of rats in each

3 討論

3.1 大鼠骨密度結果分析

OP由增齡、其他復雜因素引起全身性代謝性骨病，病理損害以骨退行性、微結構改變、單位骨量下降致骨脆性、易發骨折特征。BMD值測量仍是目前OP診斷的首選方式，也是預測骨折發生風險有效指標[17]。骨強度75%～80%由骨量決定，雙能X線吸收法測定骨密度值是判定防治OP藥物療效的金標準[18]。近年OP研究深入，Micro -CT、PET-CT掃描已被廣泛應用于OP。Micro-CT可通過目標骨骼掃描重建，除可擬和計算BMD值，具有測量骨形態學指標、骨微結構觀察等優勢。本研究顯示大鼠去卵巢術后骨量加速丟失，BMD降低，骨微結構退變，呈OP樣骨質特征。傳統醫藥可有效抑制絕經后骨骼骨吸收參數，增加BMD、全身骨礦含量[19]。去卵巢OP模鼠股骨兩端主要結構為松質骨，中間段股骨由皮質骨構成，而松質骨骨小梁占表面積大，松質骨表面骨轉換比皮質骨高多倍[20]。本研究用雙能X線吸收法測假手術組、模型組大鼠BMD。結果顯示去卵巢術后各組大鼠BMD下降明顯，表現為松質骨、皮質骨骨量相繼減少，皮質骨變薄，BMD下降；適當劑量蒙藥藍刺頭具有明顯抗PMOP作用。

3.2 大鼠骨形態學計量骨微結構(Micro-CT)結果分析

骨組織形態計量學是對骨組織形態結構行定量分析的最佳方式。本研究用Micro-CT對大鼠右側離體股骨全段掃描，操作平臺行全股骨三維重建，設定興趣區域對骨組織形態學具有代表性指標行測定分析。主要觀察BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Wi、Tb.Sp、Tb.N、Tb.Pf等指標變化。BV減小說明骨組織OP樣改變越明顯；BV/TV與OP樣改變程度成正比；Tb.Th、Tb.Wi值越小說明OP樣骨質改變越明顯；OP骨組織見骨小梁排列稀疏、髓腔增大，Tb.Sp值增大；Tb.N越少，OP樣改變越明顯；Tb.Pf與骨組織OP樣改變呈正相關。結果顯示去卵巢術后各組大鼠骨組織體積、骨小梁體積分數、骨小梁厚度、骨小梁寬度、骨小梁數目、骨小梁模塊因素下降明顯，骨小梁分離度升高明顯；適當劑量蒙藥藍刺頭可明顯提高大鼠骨組織體積、骨小梁體積分數、骨小梁厚度、骨小梁寬度、骨小梁數目、骨小梁模塊因素，明顯降低骨小梁分離度，具明顯抗PMOP作用。

綜上所述，本研究從去卵巢PMOP模型大鼠藥物干預后骨微結構變化，直觀證實蒙藥藍刺頭具較強固骨質作用，說明其增強成骨分化、骨形成力，降低骨代謝轉換水平，減少骨吸收。研究結果為蒙醫藥補暖補精-清鎮赫依-固骨質壯骨治法經典抗OP理論提供實驗依據，也為本病臨床防治、衰老相關疾病研究提供新思路，為更深入闡釋蒙醫“補腎氣(赫)-清鎮赫依-固骨質壯骨”理論科學內涵提供思路借鑒。