唑來膦酸聯合胰島素促進2型糖尿病并發雌激素缺乏大鼠骨折早期愈合

曹國龍 劉光源 劉小坡 馮云波 劉家寅 田發明

1.唐山市工人醫院骨外科，河北 唐山 063000 2.石家莊市第三醫院骨外科，河北 石家莊 050000 3.唐山市第二醫院骨外科，河北 唐山 063000 4.華北理工大學醫學實驗研究中心，河北 唐山 063210

大約40%的女性一生中會經歷一次脆性骨折[1]。而在骨折患者中，又會有10%～15%的比率出現骨折愈合延遲[2]，其中老年人會占很大比例。發生骨折的老年女性患者，常同時患有2型糖尿病和骨質疏松癥。它們不僅使骨折發生率明顯升高[3]，還不同程度地影響著骨折的愈合[4-6]。

胰島素是治療2型糖尿病的常用藥物之一，它對骨折愈合的影響值得研究。而雙膦酸鹽類藥物廣泛應用于骨質疏松患者的治療，它主要是對破骨細胞功能有明顯的抑制作用[7]。而唑來膦酸作為新一代雙膦酸鹽類藥物，每年只需靜脈輸入一次(5 mg)既可明顯降低骨質疏松性骨折的發生率[8]。并且唑來膦酸較其他抗骨質疏松藥物不僅有更好的療效[9-10]，還有著更好的依從性[11]。但長期應用此類藥物可延遲骨痂重建[12]，骨折后如何應用值得深入研究?；谝陨显?，本課題參照以往文獻[13-14]，通過高脂飼料喂養聯合注射低劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病大鼠模型。在此基礎上行雙側卵巢切除，建立2型糖尿病并發雌激素缺乏股骨干閉合性骨折動物模型，通過給予胰島素或聯合唑來膦酸治療，以研究其對于本模型骨折早期愈合的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

2月齡雌性(Sprague-Dawley，SD)大鼠，購于北京維通利華公司，許可證號：SCXK(京)2015-0001，體重(219.64±11.48) g。

1.2 實驗分組

32只大鼠隨機分為4組(n=8)：對照組(control fracture，CF)、2型糖尿病并發骨質疏松骨折組(T2DM+Osteoporosis+Fracture，DOF)、胰島素治療組(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin，DOFI)和胰島素聯合唑來膦酸治療組(T2DM+Osteoporosis+ Fracture +Insulin+Zoledronic acid，DOFIZ)。本實驗嚴格遵守實驗動物倫理原則，各項操作均通過倫理委員會批準。實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程Fig.1 Flow chart of the experimental procedures注：“_”：普通飼料喂養；“...”：高脂飼料喂養；STZ：腹腔注射STZ；OVX：雙側卵巢切除；：建立閉合性股骨干骨折模型；：取材；“Insulin”：胰島素治療；“Insulin +Zoledronic acid”：胰島素聯合唑來膦酸治療。

1.3 實驗大鼠飲食

CF組正常大鼠飼料喂養，其余3組高脂飼料喂養(H10141，北京華阜康生物科技股份有限公司)。

1.4 建立2型糖尿病及雌激素缺乏動物模型

三實驗組大鼠高脂飼料喂養3周后，以35 mg/kg給予其腹腔注射STZ[14]。一周后測晨起空腹血糖，以大于13.9 mmol/L為標準[15]，未達標者被排除。STZ注射1周后，三實驗組大鼠行雙側卵巢切除。

1.5 胰島素控制血糖

DOFI組和DOFIL組大鼠在STZ注射1周后，給予胰島素(諾和靈N，Novo Nordisk A/S)皮下注射，劑量為早2～4單位、晚4～6單位[16]。

1.6 建立股骨干閉合性骨折模型

實驗第10周建立骨折模型。手術流程：麻醉后術區剃毛、消毒、鋪單。于大鼠右膝關節內側切長約2 cm縱行切口，并屈曲膝關節，向外側脫位髕骨，于股骨髁間插入制備好的20 G注射器針頭[17]，縫合切口。用500 g重物自30 cm高度墜落撞擊，致大鼠右側股骨中段閉合性骨折[18]。

1.7 唑來膦酸給藥方法

骨折模型建立后，DOFIL組大鼠即刻以0.1 mg/kg給予唑來膦酸注射液(正大天晴藥業集團股份有限公司，規格：100 mL：5 mg)皮下注射[12]。

1.8 采集X線片并分析

骨折后第3周，通過數字放射成像系統(DR 7500)拍攝右側股骨干全長X線片，對其行骨折愈合評分[19]，并利用Image Pro Plus6.0軟件測量X線片中骨痂面積[20]。

1.9 Mirco-CT分析

利用mCT-40系統對骨痂組織掃描。設置檢測參數及測量區域：骨折線平面作為基線，向兩側各選擇381層的軸位片[21]。分析指標：骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation，Th.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨體積分數(bone volume/tissue volume，BV/TV)。

1.10番紅O-固綠染色及分析

骨組織經脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后行番紅O-固綠染色。用光學顯微鏡(奧林巴斯BX53，日本)采集圖像，通過Image Pro Plus6.0軟件分別圈選骨痂及其中的骨和軟骨組織，計算各組織所占骨痂總面積的比值[22]。

1.11抗酒石酸酸性磷酸酶染色及分析

切片經脫蠟、水合后，依次滴加抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)固定液、孵育液，經Lea蘇木素復染、脫水、透明、封片。采集圖像后分析TRAP陽性破骨細胞密度[23]。

1.12免疫組織化學染色及分析

切片經脫蠟、水合后，依次滴加胰酶、內源性過氧化物酶阻斷劑、一抗：骨鈣素(osteocalcin，OCN)抗體(bs-0470R，博奧森生物有限公司)，半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)抗體(ab179517，Abcam Corp.)，4 ℃過夜，滴加二抗(PV6000)，DAB溶液顯色，再經復染、返藍、脫水、透明和封片。采集圖像后行免疫組織化學評分(Immunohistochemical score，IHS)[24]。

1.13統計學分析

2 結果

2.1 大鼠基本情況

STZ注射后3只大鼠死亡(DOF組2只，DOFI組1只)，DOFI組和DOFIZ組各有1只大鼠血糖未達標均去除。

2.2 大鼠空腹血糖值

三實驗組大鼠在STZ注射后空腹血糖均明顯升高。胰島素治療后，DOFI組和DOFIL組大鼠空腹血糖均趨于正常。見圖2。

圖2 4組大鼠血糖變化Fig.2 Blood glucose changes in the four groups

2.3 骨折愈合X線評分及骨痂面積

DOF組和DOFI組骨折愈合X線評分顯著低于CF 組(P<0.05)，DOFI組和DOFIZ組顯著高于DOF組(P<0.05)，DOFIZ組與CF組、DOFI組間均無顯著差異；DOFIZ組骨痂面積顯著高于其余3組(P<0.05)，此3組間無顯著差異。見圖3。

圖3 各組大鼠X線表現(A)、骨折愈合X線評分(B)及骨痂面積(C)Fig.3 Representative radiographies (A), radiographic healing score (B), and callus area (C) in rats of each group注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

2.4 Micro-CT分析結果

三實驗組TB.N和BV/TV均顯著低于CF組(P<0.05)，DOFI組和DOFIZ組顯著高于DOF組(P<0.05)，DOFIZ組顯著高于DOFI組(P<0.05)；三實驗組Tb.Sp顯著高于CF組(P<0.05)，DOFIL組顯著低于DOF組和DOFI組(P<0.05)，DOF組和DOFI組間無顯著差異；4組間Tb.Th均無顯著差異。見圖4。

圖4 各組大鼠骨痂Mirco-CT三維重建圖像(A)及各指標分析結果(B～E)Fig.4 Three-dimensional reconstruction images (A) and results of micro-CT analysis of the callus (B-E)注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

2.5 番紅O-固綠染色及分析結果

CF組和DOFIZ組骨性骨痂面積比均顯著高于DOF組和DOFI組(P<0.05)，DOFI組顯著高于DOF組(P<0.05)，CF組和DOFIZ組間無顯著差異；4組間軟骨性骨痂面積比均無顯著差異。見圖5。

圖5 各組大鼠骨痂番紅O-固綠染色(×20)(A)及組織形態學分析結果(B、C)Fig.5 Safranin O-Fast Green staining of the callus (×20, A) and histomorphometric analysis results (B, C)注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

2.6 TRAP染色及TRAP陽性破骨細胞密度

CF組和DOFIZ組TRAP陽性破骨細胞密度均顯著低于DOF組和DOFI組(P<0.05)，DOFI組顯著低于DOF組(P<0.05)，CF組和DOFIZ組間無顯著差異。見圖6。

圖6 各組大鼠骨痂TRAP染色(×200)(A)及TRAP陽性破骨細胞密度(n/mm2)(B)Fig.6 TRAP staining of the callus (×200, A) and TRAP-positive osteoclasts per callus area (n/mm2, B)注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

2.7 骨痂內OCN和Caspase-3免疫組織化學染色結果及分析

三實驗組骨痂內OCN的表達均顯著低于CF組(P<0.05)，DOFI組和 DOFIZ組顯著高于DOF組(P<0.05)，DOFI組和 DOFIZ組間無顯著差異。

DOF組的骨痂內Caspase-3的表達顯著高于其余3組(P<0.05)，DOFI組和DOFIZ組顯著高于CF組(P<0.05)，DOFI組和 DOFIZ組間無顯著差異。見圖7。

圖7 各組大鼠骨痂內OCN(A)和Caspase-3(B)的免疫組織化學染色(×200)及免疫組織化學評分(C、D)Fig.7 Immunohistochemistry staining (×200, A, B) and immunohistochemical score (HIS, C, D) for OCN and Caspase-3 in the callus注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

3 討論

本實驗在2型糖尿病并發雌激素缺乏骨折動物模型基礎上，研究了單獨應用胰島素或聯合早期單劑量唑來膦酸對其早期骨折愈合的影響。結果表明，聯合用藥不僅進一步抑制了骨痂內破骨細胞活性，提高了其骨性骨痂面積比，還明顯改善了其骨痂的微結構。

本研究中，實驗大鼠并發有影響骨折愈合的兩種疾病：2型糖尿病和雌激素缺乏[25-26]，它們之間關系密切并相互影響[27-28]。DOF組不僅骨折愈合X線評分明顯低于CF組，而且其Tb.N、Tb.Sp、BV/TV、骨性骨痂面積比以及OCN的表達也明顯受損。另外，DOF組破骨細胞密度及Caspase-3的表達均明顯高于CF組，這與以往研究結果也相似[29]。DOF組骨痂各項指標受損正是以上兩種疾病共同作用的結果。

經胰島素干預后，DOF組各項受損指標中除了Tb.Sp以外均得到了明顯改善，這與以往的研究結果相似。胰島素不僅能逆轉因糖尿病引起的骨痂內軟骨細胞凋亡和破骨細胞增加[29]，還能改善其骨痂的骨量及微結構[30]。胰島素的作用可能是多方面的。首先，它直接扭轉了高血糖狀態對成骨細胞的抑制作用[27]；另外，它不僅能促進血管內皮生長因子的表達[31]，還能促進OCN的分泌[32]。本實驗結果也顯示，DOFI組OCN的表達明顯增高。盡管胰島素有諸多有利作用，但一些研究卻表明其與骨折風險增加有關[33-34]。而有趣的是，胰島素應用時間與骨折風險無關[34]，這表明骨折風險的增加可能不是來自于其對骨代謝的直接影響，而可能是由于胰島素治療引起的低血糖增加了跌倒事件中骨折的發生[35]。

DOFIZ組按0.1 mg/kg給予大鼠唑來膦酸皮下注射，這相當于人類每年接受一次的5 mg的藥物劑量[12]。骨質疏松癥患者常是在骨折發生后才被確診，此時能否立即行唑來膦酸治療值得深入研究。大鼠骨折愈合的組織學表現會比人類早1～2周，其骨折后3周相當于人類的第4～5周，是骨性骨痂形成和骨痂重塑相交的重要階段[36]，故本實驗選此時為研究靶點。破骨細胞在此時骨吸收和重建中起著重要作用[10]，而唑來膦酸的主要作用機制就是抑制其功能。本研究表明，DOFIZ組破骨細胞密度顯著低于DOFI組，而它們OCN的表達并無顯著差異，這與以往的研究結果一致[37]。另外，Caspase-3在DOFIZ組也沒有得到明顯改善。以上結果表明，早期應用唑來膦酸主要抑制了骨痂內破骨細胞功能，而對于成骨活性和軟骨性骨痂的礦化并無明顯影響。正是因為破骨細胞功能受損，使得DOFIZ組在骨折后第3周保留了更多骨性骨痂，使其骨性骨痂面積比顯著高于DOFI組，并且其骨折愈合X線評分和骨性骨痂面積比與CF組相當，甚至其骨痂面積明顯大于其他3組，Tb.N、Tb.Sp和BV/TV也得到了顯著改善，這與以往研究結果相似[12，38-39]。這些研究也表明，雖然雙膦酸鹽類藥物會延遲骨痂重建，但這并不能降低早期骨痂的結構強度，較大的骨痂反而增強了其生物力學性能。骨折端早期穩定性的增加使患者能更早的功能鍛煉，這對于控制血糖、預防多種臥床并發癥，甚至是骨痂重塑都有重要意義。

有研究還指出，破骨細胞在骨痂早期重建中并不是起骨吸收作用的唯一因素。骨痂早期重建是多種基質金屬蛋白酶協同作用的結果[40]。并且唑來膦酸單次給藥只與短期內骨痂組織結合[12]，并不影響其后新生的骨組織[39]，雖然這在一定程度上影響了早期骨痂重建，但是對于骨折的最終愈合并無明顯影響[38]。另外，唑來膦酸不僅不會增加糖尿病的患病風險[41]，還有利于減輕胰島素抵抗[42]和糖尿病并發癥的治療[43]。

本實驗結果表明，針對患2型糖尿病的絕經后女性骨折患者，在給予胰島素控制血糖的同時，可考慮早期聯合單劑量唑來膦酸治療，這對于此類患者的治療有一定的指導意義。