血漿外泌體源性lncRNAH19和lncRNAMALAT1與膀胱癌的相關(guān)性研究①

王 彤，李 升，黃立娟

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

膀胱癌(BC)是全球最常見的惡性腫瘤之一。當(dāng)前，尿液細(xì)胞學(xué)檢查缺乏排除癌癥所必需的診斷敏感性，膀胱鏡病理活檢是診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有侵入性且價格昂貴，患者接受度低。 因此，需要新的標(biāo)記物來幫助無創(chuàng)檢測和監(jiān)測膀胱癌[1，2]。外泌體是一種小的膜性囊泡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，且由于外泌體含量相對穩(wěn)定，研究已經(jīng)應(yīng)用于基因治療。 因此，尋找外泌體中的標(biāo)志物可以提高對于膀胱癌的早期篩查、早期診斷和早期治療。有證據(jù)表明，lncRNA通過表觀遺傳調(diào)控、DNA損傷和細(xì)胞周期調(diào)控、對microRNA的調(diào)控[3，4]參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和介導(dǎo)激素等方式參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有報道顯示，很多異常的lncRNA可以成為癌癥診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。本研究通過qRT-PCR分析lncRNAH19和 lncRNAMALAT1在外泌體中的表達(dá)水平，探討其與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及其對于膀胱癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017-10～2019-05在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院首次確診50例膀胱癌患者標(biāo)本及50例健康對照組標(biāo)本。標(biāo)本采集須符合以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)膀胱癌患者組采集靜脈血前均未經(jīng)手術(shù)、放療及化療等任何處理，且除膀胱癌外無其他類型腫瘤存在。(2)同時收集健康體檢者血樣50例，健康體檢者查體顯示無任何腫瘤相關(guān)疾病。(3)臨床資料齊全。所有樣本采集前均經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得患者同意并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

EDTA抗凝管采集兩組研究對象的靜脈血，分別編號予以區(qū)別。4℃，3000g離心15min，上層的透明黃色液體即為血漿，利用超速離心法提取外泌體。利用外泌體RNA提取試劑盒(Exosome RNA Extraction Kit)提取總RNA，用電腦NanoDrop3330分光光度計對RNA進(jìn)行檢測，檢測其濃度。用MonScript RTIII All-in-One Mix將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；lncRNAH19的上游引物：ACTCCAGAGCAAGCGTGTCATTC,下游引物：CTGCCTGGGGAGGGACACATG，lncRNAMALAT1上游引物：GACTACAGAGCCCCGAATTAATAC，下游引物：CATTTTCGTCTGCGTTTAGTAAATG,β-actin上游引物：ACCGAGCGCGGCTACAG：，下游引物： CTTAATGTCACGCACGATTTCC。引物均由上海生物科技有限公司合成。實(shí)時熒光定量PCR檢測，設(shè)置為95℃30s,95℃10s,60℃30s,40個循環(huán)。lncRNAH19、lncRNAMALAT1均以β-actin為內(nèi)參，用計算lncRNAH19、lncRNAMALAT1的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);定量數(shù)據(jù)采用四中位數(shù)[M(P25,P75)]，將膀胱癌血漿外泌體lncRNAH19和lncRNAMALAT1的相對表達(dá)量與相應(yīng)的臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析；ROC受試者工作特征曲線評價lncRNAH19、lncRNAMALAT1對于膀胱癌的診斷價值。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體中l(wèi)ncRNAH19、MALAT1的表達(dá)水平

lncRNAH19、MALAT1在膀胱癌組外泌體中的表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2 血漿外泌體lncRNAH19、MALAT1的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

lncRNAH19、MALAT1在外泌體中的表達(dá)與其臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

2.3 血漿外泌體中l(wèi)ncRNAH19、MALAT1對膀胱癌的診斷價值

ROC曲線分析評估lncRNAH19、MALAT1對膀胱癌的診斷價值：lncRNAH19、MALAT1的曲線下面積(AUC)分別為0.971，0.878，lncRNAH19特異性為72%，敏感度為98%；lncRNAMALAT1特異性為84%，敏感度為92%。lncRNAH19、lncRNAMALAT1聯(lián)合診斷的曲線下面積(AUC)為0.994，特異性為94%，敏感度為96%。見表3，圖1。

表1 血漿外泌體中l(wèi)ncRNAH19、MALAT1的表達(dá)水平

表2 膀胱癌患者血漿外泌體LncRNAMALAT1的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

表3 lncRNAH19、lncRNAMALAT1作為生物標(biāo)志物對于膀胱癌的聯(lián)合診斷價值

圖1 血漿外泌體lncRNAH19與lncRNAMALAT1聯(lián)合ROC受試者工作曲線

3 討論

膀胱癌(BC)作為全世界泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[5]，其復(fù)發(fā)率很高。據(jù)報道，lncrna與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，許多異常的lncRNA可以成為新的非侵襲性的生物標(biāo)志物，用于不同腫瘤的診斷和預(yù)后。來自外泌體的lncRNA已在多種體液中被檢測到。雖然核糖核酸酶存在于血液中，但由于外泌體和微泡的保護(hù)，lncRNA仍然是穩(wěn)定的。因此，來自外泌體的lncRNA具有良好的腫瘤診斷前景。本研究初步探討了膀胱癌患者血漿外泌體中l(wèi)ncRNAH19、lncRNAMALAT1的表達(dá)水平及其對于膀胱癌的診斷價值，為膀胱癌的診斷提供理論依據(jù)。

長期以來，人們一直認(rèn)為膀胱癌中的lncRNAH19表達(dá)可用作早期復(fù)發(fā)的預(yù)后標(biāo)志物[6，7]。Liu等人證實(shí)lncRNAH19的mir-675通過誘導(dǎo)G1阻滯和抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖，這可能與mir-675對抑癌基因p53[8]的負(fù)調(diào)控有關(guān)。此外，最近的研究表明，lncRNAH19是從多種癌癥中釋放出來的，并且在患者的血清中可以作為一種穩(wěn)定的形式被檢測到，這種形式可以防止內(nèi)源性RNase的侵襲。已經(jīng)證實(shí)lncRNAMALAT1在膀胱癌中的表達(dá)較鄰近正常組織表達(dá)上調(diào)，并在轉(zhuǎn)移后較無轉(zhuǎn)移的原發(fā)腫瘤有明顯升高。因此，循環(huán)血中的lncRNAH19、lncRNAMALAT1有希望成為新的生物標(biāo)志物[9]，用于癌癥的早期檢測或預(yù)后。

本研究通過qRT-PCR比較lncRNAH19、lncRNAMALAT1在膀胱癌組和健康對照組中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNAH19、lncRNAMALAT1在膀胱癌患者中的表達(dá)水平明顯高于健康對照組[10](P<0.05)，此外，我們還評估了兩種lncRNA的表達(dá)水平與其臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。最后我們繪制了ROC曲線，用來評價兩種lncRNA分子對于診斷膀胱癌的敏感度和特異性：lncRNAH19、lncRNAMALAT1的曲線下面積(AUC)分別為0.971，0.878，lncRNAH19特異性為72%，敏感度為98%；lncRNAMALAT1特異性為84%，敏感度為92%。lncRNAH19、lncRNAMALAT1聯(lián)合診斷[11]的曲線下面積(AUC)為0.994，特異性為94%，敏感度為96%。這些研究都為體液研究成為診斷膀胱癌的方式開辟了新的途徑。

但我們的研究仍然存在一定的局限性，樣本量相對有限，且由于時間限制，科研經(jīng)費(fèi)短缺及設(shè)備緊張，有些實(shí)驗(yàn)仍未進(jìn)行。本研究只選擇了健康對照組，并未加入良性病變組，若要應(yīng)用于臨床還需要擴(kuò)大樣本數(shù)量，不排除其他未知因素對膀胱癌診斷的特異性和診斷性的影響,還需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究對象進(jìn)行研究。