Klotho蛋白在UUO大鼠腎組織中的表達①

聶 晶，梅 梅，楊占雙，楊 松

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

腎臟纖維化(RIF)是一種病理生理改變，是腎臟的功能由健康到損傷，再到損壞，直至功能喪失的漸進過程，病理特點是以細胞外基質(ECM)的異常沉積。根據腎臟固有細胞受損害程度，以及是否還可以被修復，將腎臟纖維化的過程分為纖維化形成與進展的可逆階段和瘢痕形成階段，目前動物實驗的研究集中在第一階段。研究表明，在多種因素(藥物中毒、高血壓、糖尿病、慢性腎病等)作用下，腎臟固有細胞受到損傷發生功能改變，釋放一系列致腎毒性的細胞因子，導致腎間質纖維化，其中TGF-β1∕Smad3作為至纖維化的共同通路，在RIF中發揮重要作用[1]。Klotho是TGF-β1∕Smad3通路的上游基因，與衰老有關。Klotho蛋白在腎遠端小管中高表達[2]。有研究顯示，klotho蛋白參與腎間質纖維化[3]，但具體作用機制不詳盡。因此，本研究通過建立大鼠腎臟纖維化模型，觀察病變腎組織中Klotho蛋白的表達，進一步明確其至RIF的機制，可能為尋求延緩腎間質纖維化進展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、動物

兔抗大鼠Klotho多克隆抗體，MASSON染色試劑盒，DAB試劑盒， SABC免疫組化試劑盒。健康清潔Wistar 42d齡雄性大鼠48只(由佳木斯大學動物實驗中心提供)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及動物模型制作

將48只Wistar雄性大鼠飼養一周后隨機分為兩組，即正常組24只，UUO組24只。UUO組在無菌條件下行左側輸尿管結扎：術前稱重，以10%水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射麻醉，術區備皮，常規消毒，逐層進腹后，暴露腎臟，游離輸尿管，在其近端及遠端結扎，中間離斷，頭孢甲肟生理鹽水腹腔沖洗，確保無出血及漏尿后逐層縫合。正常組僅做輸尿管游離，不結扎。

1.2.2 標本收集、整理和測定

各組大鼠分別于術后第 3d、7d、14d處死，處死前內眥靜脈采血3mL，離心后行血尿素氮和肌酐檢測，處死后留取左腎組織，常規進行脫水、石蠟包埋、切邊(3μm厚)，行HE染色，MASSON染色和免疫組化染色。

1.2.3 HE染色和MASSON染色

石蠟切片進行HE染色和MASSON染色，觀察腎小管間質損傷情況和腎纖維化程度。HE染色在400倍光鏡下，觀察腎間質炎性細胞變化。MASSON染色，參考文獻[4],在400倍光鏡下，每張標本隨機選取10個不含腎小球的視野以綠染纖維(即陽性面積)與整個視野總面積的比值作為腎間質纖維化指數(RIF)。

1.2.4 免疫組化染色

石蠟切片進行免疫組化染色，在400倍光鏡下觀察klotho蛋白表達情況，細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性染色，分析計算兩組腎組織陽性染色(棕黃色顆粒)的平均光密度(IOD)。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 血BUN及Cr分析

正常組3d、7d、14d血BUN、Scr未見明顯異常與正常組相比，UUO組個時間點血 BUN、Scr明顯升高，且隨著梗阻時間逐漸加重。

2.2 HE染色結果分析

正常組的各時間點腎臟病理未見改變，UUO組隨著時間的推移，腎間質炎性細胞浸潤逐漸增多，受累腎小管出現先擴張，至第7天擴張明顯，后逐漸萎縮，腎組織出現纖維化。見圖1～4。

圖1 正常組腎組織(HE×400)

圖2 UUO組第3天腎組織(HE×400)

圖3 UUO組第7天腎組織(HE×400)

圖4 UUO組第14天腎組織(HE×400)

2.3 MOSSON染色分析

Masson 染色顯示對照組各時間點腎臟病理結構未見改變，UUO組隨梗阻時間延長，壞死程度逐漸加重，綠染的面積增大，RIF指數增加，差異有統計學意義 (P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎組織MOSSON染色RIF值

2.4 Klotho蛋白免疫組化分析

正常組各時間點腎小管上皮細胞的細胞質中可見一定量的棕黃色顆粒；與對照組相比，UUO組對應時間點腎組織中棕黃色顆粒減少，且隨梗阻時間延長，棕黃色顆粒減少越明顯，梗阻14d的腎組織細胞質中幾乎無棕黃色顆粒表達，差異有統計學意義(P<0．05)，證明在正常大鼠腎組織中有Klotho蛋白表達，隨著腎間質纖維化程度的加重，Klotho表達逐漸減少。見表2。

表2 各組大鼠腎組織Klotho蛋白表達情況

3 討論

Klotho蛋白作為單向跨膜蛋白，具有調節鈣磷作用，參與調控細胞凋亡和衰老等[5]；主要在腎小管上皮細胞中表達，可在血液及尿液中檢查到。近年來相繼有研究報道，Klotho在多種急、慢性腎臟疾病中發揮腎臟保護作用[6]。有文獻報道，Klotho蛋白是通過調節VEGF的表達，減輕腎間質纖維化。如果Klotho基因的缺乏將導致腎臟更容易受到缺氧及藥物所致的損傷[7，8]。近年來，有學者研究表明，Klotho蛋白可以抑制TGF-β1通路誘導的UUO大鼠腎臟纖維化[9]。本實驗通過建立UUO大鼠模型，分析Sham組、UUO兩組大鼠Klotho蛋白表達發現，UUO組大鼠隨梗阻時間的延長，檢測出Klotho蛋白的表達量呈下降趨勢，腎間質纖維化程度亦逐漸加重，Sham組對應時間點Klotho蛋白表達未見明顯改變，因此經本實驗研究論證Klotho蛋白在腎臟纖維化中發揮重要的功能保護作用。研究[10]表明：慢性腎臟病(CKD) 早期，血清中 Klotho 蛋白的水平便開始下降，與GFR的下降趨勢呈正比，這種變化顯然先于血肌酐、血尿素氮等指標的變化，并具有一定特異性。李莎莎[11]等通過對 130 例 CKD 患者隨訪發現腎功能顯著降低的患者，可表現出Klotho水平大幅度下降，提示Klotho蛋白水平隨腎功能的降低而下降。因此，Klotho蛋白不僅在腎臟保護方面發揮重要作用，還有望成為有CKD早期診斷的生物標志物。